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慢性束缚应激对大鼠脑内tau蛋白磷酸化及分布的影响

作　者: 闫洁
导　师: 朱粹青
学　校: 复旦大学
专　业: 神经生物学
关键词: 神经退行性疾病慢性束缚应激 Tau蛋白 MAP2
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

慢性应激可以引起机体神经精神系统功能失调,导致衰老过程加速、学习记忆障碍、阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)、抑郁等神经退行性疾患。多种神经系统退行性疾病中都出现了细胞骨架的异常。其中许多疾病出现了tau蛋白相关的病理改变,如AD中的神经原纤维缠结,提示慢性应激与tau蛋白异常之间存在相关性。异常磷酸化的tau蛋白不仅不能与微管蛋白结合,同时也使另外两种微管相关蛋白(Microtubule-associated proteins, MAPs)MAP1A/MAP1B和MAP2与微管分离,导致微管解聚。Tau分子的异常通过何种机理来导致AD等神经退行性疾病的神经退行性病变是一个关键的问题,是异常磷酸化引起正常活性丧失?还是不溶性NFT的形成?这对于神经退行性疾病的预防和治疗具有十分重要的意义,也成为了神经科学领域的研究热点之一。为了研究异常tau分子的致病机理及其与MAP2异常的关系,我们采用慢性束缚应激模型来模拟慢性应激状态,用重组缓冲液(Reassembly buffer, RAB)、RIPA缓冲液、和70%的甲酸(Formic acid, FA)分步提取脑组织蛋白。根据报道,RAB组分提取到的为可溶性异常磷酸化tau蛋白,RIPA缓冲液提取到的是可聚集为双股螺旋细丝(Paired helical filaments, PHFs)PHF-tau,而FA提取的是聚集成神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)的成分。本研究用western blot的方法检测慢性束缚应激引起tau蛋白磷酸化和MAP2丢失的特点；并制备冰冻切片,随后用免疫组组织化学、免疫荧光的方法检测了异常磷酸化tau蛋白和MAP2的分布改变情况。主要研究结果如下：1.慢性束缚应激诱导的tau蛋白磷酸化水平及形式给予动物每天1小时,连续14天的慢性束缚应激后,用两种分别识别不同tau蛋白磷酸化位点的抗体进行western blot分析,观察到可溶性磷酸化tau蛋白组分显著增多,而不可溶性磷酸化tau蛋白含量没有明显改变,FA组分中未检测到磷酸化tau蛋白条带,但检测到ATP合酶α亚单位。给予动物每天6小时,连续21天的慢性束缚应激后,进行western blot分析,结果显示可溶性磷酸化tau蛋白含量无明显变化,但不可溶性磷酸化tau蛋白含量显著增多。并在增加加样量的情况下海马FA组分中检测到磷酸化tau蛋白。我们同时检测了β-淀粉样蛋白前体蛋白APP的变化情况,结果显示,应激后,高分子量APP显著减少,而相对低分子量的APP则增加,这种变化在加重应激刺激的情况下更为显著。以上结果提示,慢性束缚应激可增加脑内tau蛋白的磷酸化,不同强度的应激刺激强度可导致磷酸化tau蛋白在不同蛋白组分中的分布差异。强的应激刺激使不溶性的磷酸化tau增加。2.慢性束缚应激诱导的磷酸化tau蛋白和MAP2的形态和分布改变免疫组织化学检测每天应激1h,连续应激14天的动物脑片,结果显示磷酸化tau蛋白在皮层、海马、丘脑和梨状皮层都有明显增加。其中大脑新皮层和海马中磷酸化tau增加明显,而杏仁核这一与情感应激紧密相关的结构呈弱阳性增加；另外,正常情况下tau蛋白主要位于神经元胞体和轴突,但是在应激刺激后磷酸化tau蛋白在皮层主要分布在胞体和树突。对于另一种微管关联蛋白MAP2的染色分析显示MAP2在树突分布明显减少,同时免疫印迹也显示MAP2表达减少；在皮层和CA3区,可见长而粗的树突突起内有串珠状退行性变结构,而较短的树突突起内有颗粒空泡状退行性变结构。免疫荧光双标结果显示,异常磷酸化tau蛋白的增多的神经元有MAP2在神经突起中的分布减少,提示在慢性应激刺激后二者在脑内的变化存在关联。另外,在每天应激1小时,连续应激14天的动物脑片上,在海马的分子层和CA3区苔状纤维有硫磺素S染色加深,提示这些部位可能存在具有beta折叠结构的蛋白。3.GSK-3是参与tau蛋白磷酸化的主要激酶之一。在慢性束缚应激刺激后,在脑内tau蛋白磷酸化增加的同时,抑制型GSK-3β的含量增加,而抑制型GSK-3α的含量却反而减少,我们推测活化型的GSK-α可能起主要作用。免疫组化检测显示GSK-3α在海马中不同部位的染色深度与磷酸化tau并不完全一致,提示在应激导致的tau蛋白磷酸化的机制中除了GSK-3α外,还有其它激酶参与。小结：1.慢性束缚应激可增加脑内tau蛋白的磷酸化,而同时有MAP2表达减少。强应激刺激使不溶性的磷酸化tau增加。2.慢性束缚应激可使皮层和海马磷酸化tau蛋白的表达增多,并主要分布在胞体和树突；MAP2在树突的分布减少,同时伴有树突退行性变的表现。磷酸化tau蛋白的增多与MAP2减少有相关性。3.慢性束缚应激可增加脑内可诱导GSK-3α活化而抑制GSK-3β活性,提示在慢性束缚应激刺激诱导tau蛋白磷酸化的机制中可能有GSK-3α参与。结论：慢性束缚应激可诱导磷酸化tau蛋白增加和MAP2的减少,二者的变化有相关性。应激诱导的tau蛋白磷酸化可能与GSK-3α的活化有关,而慢性束缚应激的强度影响磷酸化tau蛋白的可溶性。

全文目录

缩略语表  6-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
正文  13-63
  前言  13-15
  材料与方法  15-23
    1.实验动物与分组  15
    2.主要药品及试剂  15-16
    3.主要仪器  16
    4.有关溶液的配制  16-18
    5.实验方法  18-21
      5.1 束缚应激动物模型制备  18
      5.2 冰冻脑组织切片的制备  18
      5.3 磷酸化tau蛋白pS202抗体免疫组织化学染色  18-19
      5.4 MAP2免疫组织化学染色  19
      5.5 P-GSK-3β免疫组织化学染色  19
      5.6 P-GSK-3α免疫组织化学染色  19
      5.7 免疫荧光双标记(磷酸化tau蛋白pS202/MAP2)  19-20
      5.8 硫磺素S(Thioflavin S)染色  20
      5.9 动物脑组织磷酸化tau蛋白提取  20
      5.10 BCA法测定蛋白浓度  20
      5.11 Western blot免疫印迹  20-21
        5.11.1 磷酸化tau蛋白pS202免疫印记  20-21
        5.11.2 β-actin免疫印记  21
        5.11.3 磷酸化tau蛋白pS396免疫印记  21
        5.11.4 总tau蛋白免疫印记  21
        5.11.5 MAP2免疫印记  21
        5.11.6 P-GSK-3β免疫印记  21
    6.图像处理积分光密度分析  21-22
      6.1 免疫组化阳性细胞积分光密度分析  22
      6.2 Western印迹蛋白条带积分光密度分析  22
    7.统计分析  22-23
  实验结果  23-52
    1.慢性束缚应激后,tau蛋白磷酸化水平的改变  23-35
      1.1 对动物进行每天1小时,连续14天的慢性束缚应激后,tau蛋白磷酸化的改变  23-25
        1.1.1 Ser202位点可溶性磷酸化tau蛋白的变化  23
        1.1.2 Ser202位点不可溶性磷酸化tau蛋白的变化  23-24
        1.1.3 Ser396位点可溶性磷酸化tau蛋白的变化特点  24
        1.1.4 Ser396位点不可溶性磷酸化tau蛋白的变化特点  24
        1.1.5 FA组分中磷酸化tau蛋白的变化  24
        1.1.6 FA组分中检测到ATP合酶α亚单位  24-25
        1.1.7 慢性束缚应激后APP的改变  25
      1.2 对动物进行每天6小时,连续21天的慢性束缚应激后,tau蛋白磷酸化的特点  25-26
        1.2.1 皮层Ser202位点磷酸化tau蛋白的变化  25
        1.2.2 海马Ser202位点磷酸化tau蛋白的变化  25-26
        1.2.3 FA组分中磷酸化tau蛋白的变化  26
        1.2.4 对动物进行每天6小时,连续21天的慢性束缚应激后,APP的改变  26
      1.3 慢性束缚应激后硫磺素S染色  26-27
      第一部分图表说明  27-35
    2.慢性束缚应激引起的脑内tau蛋白分布改变特点  35-41
      2.1 磷酸化tau蛋白在大鼠皮层内的分布特点  35
      2.2 磷酸化tau蛋白在大鼠海马的分布特点  35
      2.3 磷酸化tau蛋白在大鼠梨状皮层的分布  35-36
      2.4 磷酸化tau蛋白在大鼠杏仁核和丘脑的分布  36-37
      第二部分图表说明  37-41
    3.慢性束缚应激后,脑内MAP2分布改变特点  41-45
      3.1 应激后MAP2在大鼠皮层的分布特点  41
      3.2 应激后MAP2在大鼠海马的分布特点  41-42
      第三部分图表说明  42-45
    4.慢性束缚应激后,免疫荧光双标记脑内磷酸化tau蛋白和MAP2的定位特点  45-48
      4.1 慢性束缚应激后,磷酸化tau蛋白和MAP2在皮层的定位  45
      4.2 慢性束缚应激后,磷酸化tau蛋白和MAP2在海马的定位  45
      4.3 应激后MAP2在大鼠脑内的水平改变  45-46
      第四部分图表说明  46-48
    5.Tau蛋白磷酸化机制的初步探讨  48-52
      5.1 应激后,P-GSK-3β在大鼠皮层的分布特点  48
      5.2 应激后,P-GSK-3β在大鼠海马的分布特点  48
      5.3 应激后,P-GSK-3β水平的改变  48
      5.4 应激后,P-GSK-3α在大鼠海马的分布特点  48-49
      第五部分图表说明  49-52
  讨论  52-57
    1.应激的研究背景  52
    2.应激与tau蛋白磷酸化  52-54
    3.应激后磷酸化tau蛋白脑内分布特点  54-55
    4.应激后磷酸化tau蛋白与MAP2  55-56
    5.应激后磷酸化tau蛋白与APP  56
    7.Tau蛋白磷酸化的机制  56-57
  小结  57
  结论  57-58
  参考文献  58-63
综述  63-75
致谢  75-76
硕士研究生期间发表及完成的论文  76-77

慢性束缚应激对大鼠脑内tau蛋白磷酸化及分布的影响

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