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抗CDK4人源胞内单链抗体在肿瘤细胞中的表达及生物活性分析

作　者: 冯晶
导　师: 李桂英
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: CDK4 胞内单链抗体细胞周期肿瘤基因治疗
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 44次
引　用: 2次
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内容摘要

CDK是一类依赖cyclin的蛋白激酶,在细胞周期调控网络中处于中心地位。CDK4作为细胞进入增殖周期的第一个被激活的周期蛋白依赖性蛋白激酶,是细胞周期进程中G1/S期转换的限速因子。CDK4的活化状态是细胞能否进入增殖周期的关键。许多研究表明,CDK4与肿瘤的发生、发展和预后关系密切。CDK4对细胞周期的调节作用,主要表现在其与cyclin D1特异性结合形成复合物,该复合物能够推进细胞周期G1期到S期的演进。研究者们通过对CDK4基因敲除等策略作用于多种肿瘤细胞时,肿瘤细胞的生长均得到了有效的控制。因此,CDK4已经成为人们进行肿瘤基因治疗的靶点之一。胞内抗体技术是近年来兴起的以抗体作为效应分子的能够在细胞内高效地、特异地灭活靶蛋白,并实现蛋白表型敲除的一种技术。通过对单链抗体基因编码蛋白的N端或C端进行修饰后可以形成不同定位型的单链抗体,从而可以在细胞内任意区间灭活靶蛋白,为肿瘤的基因治疗开辟了新的思路。为此,本研究克隆了细胞核定位型抗人CDK4胞内scFv基因(NLS-AK),并成功构建其重组真核表达载体pNLS-AK,通过细胞转染、RT-PCR、免疫荧光、Western-blot、免疫共沉淀、MTT法生长增殖特性分析、流式细胞术等方法分别对NLS-AK的表达及胞内定位情况、体外生物活性等进行了研究。结果表明,NLS-AK基因能够在肿瘤细胞中有效表达并实现胞内抗体的目标定位。NLS-AK基因的稳定表达能够显著抑制细胞生长和增殖,引起细胞周期阻滞,并明显诱导细胞凋亡。综上所述,以CDK4为靶点的胞内抗体治疗作为一种新型肿瘤基因治疗方法,具有潜在的应用价值。

全文目录

提要  4-8
第一章引言  8-21
  1.1 肿瘤的基因治疗  8-15
    1.1.1 反义技术  8-11
    1.1.2 RNA 干扰技术  11-12
    1.1.3 胞内抗体技术  12-15
  1.2 CDK4 与肿瘤  15-19
    1.2.1 CDK4 的发现及生物学特点  16
    1.2.2 CDK4 蛋白在细胞周期调控中的作用  16-17
    1.2.3 CDK4 的活性调节机制  17-18
    1.2.4 CDK4 与肿瘤  18-19
  1.3 本研究的立题目的与意义  19-21
第二章实验研究  21-40
  2.1 实验材料  21-27
    2.1.1 菌株、质粒和细胞株  21
    2.1.2 引物设计  21-22
    2.1.3 主要试剂与溶液  22-26
    2.1.4 主要仪器  26-27
    2.1.5 计算机辅助工具  27
  2.2 实验方法  27-40
    2.2.1 真核表达质粒pNLS-AK 的构建  27-33
    2.2.2 表达质粒pNLS-AK 的体外活性分析  33-40
第三章实验结果  40-55
  3.1 表达质粒 pNLS-AK 的构建与鉴定  40
  3.2 NLS-AK 在肿瘤细胞中的瞬时表达及分析  40-42
    3.2.1 RT-PCR 检测NLS-AK 的表达  40-42
    3.2.2 NLS-AK 的胞内表达及定位分析  42
    3.2.3 Western-blot 分析  42
  3.3 pNLS-AK 稳定转染的肿瘤细胞的鉴定  42-46
    3.3.1 RT-PCR 检测NLS-AK 的表达  42-46
    3.3.2 间接免疫荧光实验分析  46
    3.3.3 Western-blot 分析  46
  3.4 胞内抗体NLS-AK 的免疫共沉淀实验  46-48
  3.5 NLS-AK 抑制肿瘤细胞生长  48-49
  3.6 NLS-AK 引起肿瘤细胞的细胞周期阻滞  49
  3.7 NLS-AK 能够诱导肿瘤细胞凋亡  49-55
第四章讨论  55-58
  4.1 肿瘤基因治疗靶点的选择  55
  4.2 细胞核定位型胞内抗体NLS-AK 的生物学活性  55-58
第五章结论  58-59
参考文献  59-67
中文摘要  67-71
ABSTRACT  71-73
致谢  73

抗CDK4人源胞内单链抗体在肿瘤细胞中的表达及生物活性分析

内容摘要

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