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乙型肝炎病毒基因组的垂直传递及其突变与表达

作　者: 王培林
导　师: 张学成
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 基因组 乙型肝炎病毒 乙型肝炎 睾丸 卵巢 乙肝患者 小鼠 垂直传递
分类号: R373.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


乙型肝炎(简称乙肝)是乙型肝炎病毒(HBV)感染所致,是一种难治性的严重危害人类健康的常见病与多发病,是与慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌发生关联的疾病。据统计,世界上约有3亿五千万人携带HBV,每年新增乙肝患者50万～100万,我国感染人数约占世界感染人数的50%。乙肝每年导致至少200万人死亡。然而,迄今乙肝尚无特异有效的临床治疗对策与措施,乙肝的发生率尚未显著降低。因此,HBV感染的传播方式受到研究者们的关注;乙肝经生殖细胞垂直传播的途径尚未得到证实,有关研究报道甚少。HBV是目前所知的最小的嗜肝病毒。HBV DNA长约3.2kb,构成HBV基因组,为部分双链环状病毒。HBV基因组共有4个开放阅读框架P、C、S和X区。本文报道了HBV基因组在男、女乙肝患者睾丸组织、卵巢组织中的基因复制、基因表达和基因突变,HBV基因组在乙肝患者父子、母子间垂直传递,HBV基因组小鼠卵细胞载体的构建和精细胞载体的构建与转HBV基因组小鼠的垂直传递。本研究从分子遗传学、细胞生物学和组织学等方面为HBV基因组经精细胞和卵细胞垂直传递提供了实验证据;乙肝患者的研究和动物实验证明,受到HBV感染的乙肝患者的生殖细胞能够把HBV基因组传递给其发病后出生子女。本文为乙肝垂直传播的理论提供了证据,为HBV感染的干预(如乙肝疫苗的应用等)提供了理论基础和依据。乙型肝炎患者父亲发病后出生子女本文首先研究分析了较大家系、样本的乙型肝炎患者父亲(HBF)、乙型肝炎患者父亲发病后出生子女(HBFa)和乙型肝炎患者父亲发病前出生子女(HBFb)各实验组血清游离型、外周血单核细胞(PBMC)整合型HBV基因组检测率和HBV感染率,发现HBF、HBFa组的3项指标显著高于HBFb组,HBF与HBFa组的3项指标呈一致性增高。说明HBFa组的HBV基因组有可能从HBF组获得。进一步分析了整合在HBF与HBFa基因组内的HBV基因组突变,发现HBF与HBFa父子之间具有完全一致的聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)单链泳动变位;所分析的的3个家系5个成员的HBF与HBFa的HBV基因组,有U5样序列区和非U5样序列区的3个位点的单核苷酸多态性(SNP)突变位点完全一致,HBF家系2301父子U5样序列区和非U5样序列区的10个位点的SNP突变位点完全一致。提示HBFa的所有HBV基因组的SNP都应是由整合有HBV基因组的HBF基因组通过精细胞传递所致。为了在产生精细胞的睾丸及附睾组织寻找到组织与细胞学证据,作者又研究了HBF的睾丸及附睾组织细胞内的HBV基因组,发现在HBF睾丸及附睾组织中存在大量的HBV基因组,主要分布在曲细精管的基底部。显然,为HBV基因组在父子之间的垂直传递提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组父子间垂直传递的研究为首次报道。第二,首次大样本的研究了乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)均阳性乙肝患者母亲(HBM)孕妇的卵巢组织样本HBV基因组基因的表达,检测HBsAg在卵巢组织的分布与表达,发现HBsAg主要分布在卵巢组织的血管管壁及周围的间质细胞内,在卵巢皮质的卵泡细胞胞质中检测到HBsAg。说明在卵巢组织和卵泡细胞内存有HBV基因组,卵巢组织和卵泡细胞受到了HBV的感染。为母婴之间HBV基因组通过卵细胞的垂直传递提供了组织学与细胞学的证据。进一步分析了HBM卵巢组织与外周血、HBM新生儿脐带血存在的HBV基因组。发现在HBM卵泡组织中检测到HBV基因组,其检测率与HBM新生儿脐带血中HBV基因组的检测率呈一致性增高,显著高于对照组。说明HBM新生儿细胞内的HBV基因组可能是来自HBM,是通过卵细胞传递而来。因为HBM孕妇的卵巢组织样本HBV基因组的免疫组化研究结果已提供了组织学与细胞学的基础。同时,本文进一步研究了HBM卵巢石蜡组织切片组织细胞内的HBV基因组与分布,发现在HBM卵巢组织中检测到HBV基因组,分别分布在卵巢皮质的卵泡细胞,髓质的血管管壁以及血管周围间质细胞中。说明HBV感染了卵巢组织,在卵巢组织和卵泡细胞中存在HBV基因组。又进一步为母婴间通过卵细胞垂直传递HBV基因组提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组母子间垂直传递的研究为首次报道。第三,应用人的生殖细胞进一步研究HBV基因组的垂直传递,涉及伦理学的问题,显然是不可能的。我们应用阳离子脂质体-质粒pBR322-HBV DNA共转染小鼠卵细胞,证明HBV基因组可以通过脂质体转染进入小鼠卵细胞,卵细胞可以作为HBV基因组的载体;为培育证明HBV基因组可以经卵细胞垂直传递子代的动物模型提供了前提条件。第四,运用精子载体共培养和体内转染法共转染小鼠精细胞,发现小鼠精子有一定俘获外源HBV基因组的能力,并发现HBV基因组在小鼠精细胞的分布。作者应用精子载体法建立了HBV基因组经精细胞垂直传播的转HBV基因组小鼠模型。为HBV基因组经生殖细胞垂直传递提供了实验证据。为HBV感染的垂直传播提供了实验证据。HBV基因组垂直传递的研究有助于探讨、阐明HBV感染传播的机制与途径。除在乙肝传播的理论上有所突破之外,还将为HBV感染的临床预防提供理论依据和基础;这在降低乙肝发生率、提高人口素质、优生优育等方面都有重要的临床意义。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-17
第一章 文献综述  17-40
  1. 乙型肝炎病毒 的学位论文">乙型肝炎病毒(HBV)及其基因组的生物学特性  17-21
    1.1 HBV 及其基因组  17-20
    1.2 HBV 基因组的生物学特性  20-21
  2. HBV 感染的嗜肝性和泛嗜性  21-22
  3. HBV 感染的传播方式  22-25
    3.1 母婴传播  23
    3.2 宫内感染  23-24
    3.3 分娩期感染  24
    3.4 产后感染  24-25
  4. 乙肝的遗传学研究进展  25-35
    4.1 遗传流行病学研究进展  25
    4.2 细胞遗传学研究进展  25-29
    4.3 分子遗传学研究进展  29-35
  5. HBV 基因组通过生殖细胞进行垂直传递的研究  35-38
    5.1 HBV 基因组通过精子垂直传递的研究  35-37
    5.2 HBV 基因组通过卵子垂直传递的研究  37-38
  6. 问题和展望  38-40
第二章 HBV 基因组在乙肝患者睾丸组织中的表达与父子间单核苷酸多态性分析  40-66
  1 前言  40-41
  2. 材料与方法  41-48
    2.1 研究对象与材料  41
    2.2 实验试剂与试剂成分  41-42
    2.3 常用实验仪器  42-43
    2.4 实验方法  43-48
  3. 结果  48-59
    3.1 HBV 基因组U5 样序列的检测  48-50
    3.2 HBF 及其HBFa 和 HBFb HBV 感染率  50-51
    3.3 PCR-SSCP 分析  51-52
    3.4 HBV 基因组U5 样序列SNP 分析  52-54
    3.5 HBF 睾丸及附睾石蜡包埋组织HBV 基因组PCR 检测  54-56
    3.6 巢式PCR 扩增阳性的HBF 睾丸及附睾组织原位杂交结果  56-59
  4. 讨论  59-66
    4.1 乙肝的遗传流行病学分析  59-60
    4.2 血清游离型HBV 基因组检测与垂直传递  60-61
    4.3 PBMC 整合型HBV 基因组检测与垂直传递  61-62
    4.4 HBV 基因组的PCR-SSCP 突变分析与突变的垂直传递  62
    4.5 HBV 基因组的SNP 分析与SNP 的垂直传递  62-64
    4.6 HBF 睾丸及附睾组织HBV 基因组的存在  64
    4.7 FISH 技术对HBV 基因组在组织细胞内的准确定位  64-66
第三章 HBV 基因组在乙型肝炎患者卵巢组织中的表达与垂直传递  66-95
  1. 引言  66-67
  2. 材料和方法  67-75
    2.1 研究对象  67
    2.2 试剂与器材  67-69
    2.3 器材及来源  69
    2.4 方法  69-75
  3. 结果  75-89
    3.1 HBM 卵巢组织HBsAg 的表达  75-79
    3.2 孕妇卵泡组织及其新生儿脐带血HBV 基因组的PCR 扩增  79-82
    3.3 HBM 的卵巢石蜡切片FISH 检测  82-85
    3.4 HBM 卵巢组织与卵泡细胞HBV 基因组表达的免疫组化检测结果的统计学分析  85-86
    3.5 HBM 卵泡及新生儿脐带血HBV 基因组PCR 方法检测结果的统计学分析  86-87
    3.6 HBM 卵泡组织FQ-PCR 检测HBV 基因组  87-89
  4. 讨论  89-95
    4.1 HBsAg 在卵巢组织的表达  90-93
    4.2 HBM 母子间的HBV 基因组的垂直传递  93-94
    4.3 研究HBV 基因组经卵细胞垂直传递的意义  94-95
第四章 HBV 基因组小鼠卵细胞载体的构建  95-112
  1. 引言  95
  2. 材料与方法  95-101
    2.1 研究对象  95
    2.2 材料与方法  95-96
    2.3 器材及其来源  96-97
    2.4 方法  97-101
    2.5 实验结果的统计学处理  101
  3. 结果  101-107
    3.1 小鼠单个卵细胞的分离及透明带的消化  101-103
    3.2 小鼠卵细胞中HBV 基因组检测结果  103-106
    3.3 转染小鼠卵细胞内及卵巢组织中 HBV 基因组检测结果的统计学分析  106-107
  4. 讨论  107-112
    4.1 小鼠卵细胞俘获HBV 基因组  107-109
    4.2 HBV 基因组通过小鼠卵细胞垂直传递  109-112
第五章 HBV 基因组小鼠精细胞载体的构建及转基因小鼠的垂直传递  112-140
  1. 引言  112
  2. 材料与方法  112-126
    2.1 实验材料  112-117
    2.2 实验方法  117-126
  3. 结果  126-134
    3.1 小鼠精细胞俘获HBV 基因组的检测  126-127
    3.2 小鼠精子俘获外源HBV 基因组的原位杂交检测  127-130
    3.3 提取幼鼠尾DNA，检测HBV 基因组  130-131
    3.4 检测转基因小鼠HBV RNA 的表达  131-132
    3.5 HBV 检测结果的统计学分析  132-134
  4. 讨论  134-140
    4.1 小鼠精细胞对外源基因具有主动捕获性  134-135
    4.2 体外转染外源PBR322-HBV DNA 进入鼠精细胞  135-136
    4.3 PCR 和FISH 方法检测精子捕获外源HBV 基因组  136
    4.4 经输精管及附睾管内精子细胞转染法建立HBV 基因组垂直传递的小鼠模型  136-140
总结  140-142
参考文献  142-158
附录  158-162
攻读博士学位期间发表的论文、著作  162-163
致谢  163

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒） > 肠道病毒与肝炎病毒
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