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活性氧在鼠血管增龄性变化中的作用及脱氢表雄酮的干预研究

作　者: 阮云军
导　师: 吴赛珠
学　校: 第一军医大学
专　业: 心血管病学
关键词: 血管衰老去氢表雄酮活性氧簇
分类号: R543.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

人口老龄化是廿一世纪人类发展的主要特征，在我国尤其明显。根据今年新公布的国家人口发展战略研究报告表明，二十世纪末，中国60岁以上老年人口占总人口的比例超过10％；2005年底，中国60岁以上老年人口近1.44亿，占总人口的比例达11％；当前，中国老年人口正以年均约3％的速度增长，并将以每10年纯增1亿老年人口的速度加速老龄化进程。随着老年人口的增多，我国老年人疾病谱也由相对分散向集中转变，发病率前五位是高血压、冠心病、脑血管病、糖尿病、肿瘤。其中以动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）为表现的心脑血管病在老年人群中的高发病率、高致死率、高致残率使其成为威胁老年人健康的首要疾病。因此急需开展AS发病机制及防治对策的研究。AS发生的传统危险因素包括高血压、高血脂、吸烟、高血糖、年龄以及性别等，以往一直认为年龄属于AS不可改变的危险因素，因而研究相对较少。随着人口老龄化的日益发展，有关年龄在AS发生发展机制中作用的研究逐渐引起重视，并成为防治AS的新靶点。流行病学研究表明年龄是AS发生与发展的独立的危险因素，随着年龄的增加，促使AS的发生率显著升高的一个最具有老年人群特点的原因是血管随增龄发生了变化，部分血管细胞发生了衰老。在老龄人的血管，血管的结构发生显著的改变、血管管腔扩大而弹性降低、血管壁的细胞发生功能障碍，血管壁基质成分也发生显著的变化。这些独立于动脉粥样硬化之外而发生的衰老变化改变了各种心脑血管疾病的病理生理机制，从而改变了疾病发生的阈值、严重程度和预后。那么随着增龄血管为什么会发生这些变化，血管细胞为什么会衰老，隐藏在血管这些变化后的细胞和分子水平的病理学机制是什么?这种机制是否可为改善或者延缓AS提供重要思路?在人口老龄化日益发展的现状下，这已成为AS防治亟需回答的关键问题之一。对于血管增龄性变化机制的研究首先涉及的是衰老机制问题。目前有关衰老机制的学说有数十多种，总体来说最终归结为两大类型：一类是以活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）、糖基化等损害为代表的环境伤害衰老理论，另一类是以端粒缩短、衰老基因、细胞周期调控因子等为代表的遗传因子程序化衰老理论，这两大类理论从不同角度阐述了机体衰老的可能机制，使衰老的研究不断向细胞、分子和基因水平深入。由于衰老是一个复杂的过程，环境与遗传因素都影响着衰老的过程，因此当今有关衰老的研究已经逐步走进了将这两种理论进行合作的时代，并将发掘衰老的机制和延缓衰老的努力集中在一个相对明确的范围之内，即集中在环境因子伤害造成的增龄性衰老改变的相关范围之内。目前有关衰老的研究对象大多采用成纤维细胞，而很少针对特定组织和细胞，但相关的研究进展对我们理解血管等特定组织细胞的衰老机制提供了重要信息。我们认为对于血管增龄性变化的细胞和分子机制的研究应根据血管的特点而有所侧重。血管是人体的一个重要组成部分，其解剖部位位于易损伤的功能性界面，血液循环以及血管自身形成的各种内、外环境损伤因素，特别是以ROS为主要形式的氧自由基的损伤首先作用于血管壁细胞。ROS是指分子氧单电子还原后生成的化学反应性质活泼（如还原性强、高能、不稳定）的某些氧代谢产物及其衍生物，包括过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O₂^-）、羟基（·OH）、单线氧和脂质代谢产物。研究表明过量的ROS所引起的氧化应激在血管病变，尤其是在AS中扮演重要角色，ROS通过氧化应激诱导一些炎症因子基因的表达独自或联合参与了AS的形成过程。随着年龄的增长，这些因素在血管壁所造成的损伤不断积累，很可能成为诱导血管衰老发生与发展的最重要因素之一，从而使老年人更容易发生AS。实验研究已通过ROS（如H₂O₂）慢性氧化应激在成纤维细胞中诱导出早衰模型，那么由慢性ROS氧化应激能否引起血管细胞衰老?在衰老个体血管中会发生何种与ROS有关的改变，衰老个体的血管细胞对ROS产生的氧化应激反应性如何，是否更容易进展为AS?等等这一系列的问题尚有待研究，而对其进行阐明不仅有助于理解血管增龄性变化的病理学机制，同时也为老年人AS的防治提供了新的研究靶点。在增龄过程中，除了血管衰老本身因素之外，老年人易发AS的另一个具有显著特点的危险因素是体内随年龄增加而发生的性激素平衡的改变。在增龄过程中，体内性激素发生相应变化，其中性激素水平在更年期后发生的变化显示出性激素对机体作用的最大重要性。男性50岁后体内总睾酮以及生物活性睾酮水平显著降低，女性绝经期后体内雌激素水平下降更为迅速和明显，与此同时性激素靶器官的功能随之发生显著变化。女性低雌激素状态，男性低睾酮状态已被多个临床研究证实是AS的易患因素之一，但由于机体对性激素水平的调节以及机体对性激素水平变化的应对是一个相当精细和复杂的过程且存在个体差异，试图通过外在地调整性激素平衡来预防或延缓AS发生并非象想象的那么简单，人为地补充性激素尤其是雌激素能否延缓AS发生与发展目前存在着争议。但与这种争议不同的是，现有的研究对性激素前体脱氢表雄酮（Dehydroepiandroslerone，DHEA）在AS和多种老年疾病发病中的有益作用基本上都持肯定态度。DHEA是肾上腺皮质分泌的雄激素前体，少量转化为雌激素。DHEA是人体内数量很大的甾体激素，随年龄的增长而不断稳定下降。流行病学研究表明DHEA与AS、免疫功能减退、骨质疏松、肿瘤、认知功能减退、生活质量降低等衰老有关疾病密切相关，已证实血浆DHEA水平与AS等多种老年疾病发病率呈显著负相关，补充适当的DHEA对这些疾病具有延缓作用。目前部分国家已将DHEA作为食品添加剂应用，有关DHEA副作用的报道很少，其作用的机制成为老年医学研究的热点之一，但现有研究大多针对DHEA在特定疾病的特殊发展过程的干预作用展开。已明确DHEA的机制除具有部分性激素活性外，尚有自身独特的生理机制，这些机制目前尚未完全明确。我们认为DHEA对多种老年疾病的有益作用，暗示着延缓衰老发生发展的普遍过程可能是其作用的重要机制，DHEA可能能通过干预器官衰老的进程而延缓多种老年疾病的发生与发展。但目前有关DHEA与器官衰老的关系研究很少。本研究将探讨DHEA对血管增龄性变化过程的干预作用。根据上述这些观点，我们设想ROS慢性氧化应激可引起血管细胞的衰老，随着年龄的增加，血管抗氧化酶活性可能会发生变化，血管中ROS相关物质随之发生变化，从而参与了血管衰老的发生；随着年龄的增加，血管细胞对ROS敏感性增强，更容易进展为AS；DHEA可能能延缓上述过程。根据这些设想，本研究以H₂O₂为ROS的代表，围绕着以下三个方面进行了研究：一、三丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP）诱导血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）衰老及DHEA的干预作用本研究以目前公认的衰老标志物：衰老相关β-半乳糖苷酶活性和细胞的增殖能力为主要观察指标，首先对t-BHP诱导VSMC衰老的可能性进行了实验观察。β-半乳糖苷酶活性采用免疫化学染色方法，采用流式细胞术检测细胞周期来反应细胞增殖能力，并检测了细胞内丙二醛（Maleic Dialdehyde，MDA）的含量。结果表明经80mmol／L的t-BHP持续作用72h后，VSMC出现了衰老的表型，G0／G1期细胞的比例和SA-β半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比增加，部分细胞已发生凋亡和坏死，细胞内MDA显著增加，从而表明t-BHP成功诱导了VSMC衰老。这提示ROS是引起血管细胞衰老的重要机制之一。此外，同单用t-BHP处理细胞相比，在t-BHP处理前给予100nmol／L DHEA，能有效减少衰老表型VSMC比例，G0／G1期细胞的比例和SA-β半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比减少，凋亡和坏死细胞亦显著减少，细胞内MDA含量显著降低。提示预防性使用一定剂量的DHEA能延缓ROS引起的VSMC衰老，这种作用部分是通过抗氧化作用达到的，这可能是DHEA作用的一种共性机制。二、大鼠动脉ROS相关物质的增龄性变化及DHEA干预作用为进一步探讨ROS与血管增龄性变化的关系及其在血管衰老中的作用，我们从动物模型角度观察了增龄过程中血管ROS相关物质的变化情况。实验用Wistar大鼠，分3组：12月龄组、18月龄组、DHEA干预组（18月龄，12月龄时开始在喂养基础饲料中添加DHEA 1 mg／kg·d）。取胸主动脉，比色法测超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性和MDA含量，western blot法测一氧化氮合酶（endotheilial Nitric oxide sythase，eNOS）蛋白表达，Griess法测定一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量，放射免疫法测环磷酸鸟苷（cyclic Guanosinemonophosphate，cGMP）含量。结果显示与12月龄鼠组比较：（1）18月龄鼠动脉中，反映脂质过氧化程度高低的MDA含量明显升高，而反映清除氧自由基的能力的抗氧化酶SOD活性显著降低；（2）18月龄鼠主动脉中eNOS的蛋白表达显著减少，NO含量和cGMP含量明显降低；给予DHEA干预的18月龄鼠组上述变化均明显改善。这些结果表明随着增龄，鼠血管本身抗氧化酶活性减弱，对ROS的清除能力降低，脂质过氧化的程度加重；与此同时，血管中eNOS的蛋白表达呈显著降低的趋势，NO产生减少，对ROS清除能力进一步降低；由于缺乏足够的NO的有效激活，VSMC的鸟苷酸环化酶活性降低，使cGMP的含量明显降低，从而降低了NO的效应。以上环节参与了随增龄而发生的血管功能受损的过程，从而在血管衰老发生中起着重要作用。DHEA能改善大鼠动脉因增龄引起的ROS相关物质变化，从而可能是延缓血管衰老的一种有效物质。三、鼠VSMC对H₂O₂刺激反应的增龄性变化及DHEA干预作用在第二部分研究基础上，我们培养了18月龄和3月龄大鼠的VSMC，比较了不同年龄大鼠VSMC对急性H₂O₂应激反应的差异。采用MTT法测定细胞的增殖能力，免疫细胞化学法分析核因子p65（Nuclear factor-kappa B p65，NF-kB p65）核易位情况；RT-PCR法测单核细胞趋化因子-1（monocytechemoattractant protein-1，MCP-1）mRNA的表达；比色法测细胞MDA含量。结果表明18月龄大鼠VSMC增殖能力对H₂O₂刺激较3月龄大鼠VSMC有着更强的敏感性，在低浓度H₂O₂作用时表现为更强的增殖能力，而在高浓度H₂O₂作用下更容易发生增殖力降低、坏死和凋亡。同3月龄组VSMC比较，50μmol／L H₂O₂作用6h，18月龄组VSMC NF-kB核易位率和MCP-1mRNA表达水平均显著升高，提示随着年龄的增加，VSMC在ROS作用下更容易诱导炎症因子的释放和诱导VSMC的增殖，从而更容易进展为AS。我们同样观察到，给予一定浓度DHEA预处理，能有效抑制H₂O₂引起的18月龄鼠VSMC的NF-kB活化和炎症因子MCP-1 mRNA的表达，从而进一步证实，DHEA能干预ROS对老龄大鼠血管细胞的损伤，从而可能延缓血管衰老的进展。结论通过本研究，我们能够得出以下结论：1.80mmol／L的t-BHP持续作用72h后，VSMC细胞内MDA显著增加，G0／G1期细胞的比例和SA-β半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比增加，细胞发生了衰老。提示ROS是引起血管细胞衰老的重要机制之一。2．随着增龄，鼠血管抗氧化酶SOD活性减弱，脂质过氧化产物MDA含量增加；血管中eNOS的蛋白表达呈显著降低，NO产生减少，cGMP的含量明显降低。这些与ROS密切相关的物质随增龄所发生的变化，可能是引起血管衰老发生的一种重要原因。3．在H₂O₂刺激下，18月龄大鼠VSMC增殖能力较3月龄大鼠VSMC有着更强的敏感性，在低浓度H₂O₂作用时表现为更强的增殖能力，而在高浓度H₂O₂作用下更容易发生增殖力降低、坏死和凋亡。4．在50μmol／LH₂O₂作用6h下，18月龄大鼠VSMC的NF-kB核易位率、MCP-1 mRNA表达量和VSMC的增殖能力高于3月龄大鼠VSMC。表明随着年龄的增加大鼠VSMC对ROS的应激更加敏感。5．一定浓度的DHEA能延缓上述过程的发生与发展，这些作用至少部分是通过抗氧化作用达到的，提示DHEA可能是延缓血管衰老的一种有效物质。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-18
前言  18-20
第一章三丁基过氧化氢诱导VSMC衰老及DHEA干预作用  20-46
  1.1 材料与方法  20-26
  1.2 结果  26-33
  1.3 讨论  33-42
  1.4 参考文献  42-46
第二章大鼠动脉活性氧相关物质的增龄性变化及DHEA干预作用  46-60
  2.1 材料与方法  46-51
  2.2 结果  51-54
  2.3 讨论  54-58
  2.4 参考文献  58-60
第三章鼠VSMC对H_2O_2刺激反应的增龄性变化及DHEA干预作用  60-82
  3.1 材料与方法  60-66
  3.2 结果  66-74
  3.3 讨论  74-79
  3.4 参考文献  79-82
结论  82-83
附录  83-98
  1.1 英文缩略词表  83-85
  1.2 攻读学位期间成果  85-86
  1.3 文献综述  86-98
致谢  98-100

活性氧在鼠血管增龄性变化中的作用及脱氢表雄酮的干预研究

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