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乳酸菌表达系统的初步构建及应用

作　者: 张虎成
导　师: 陈薇
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 乳酸菌 活菌疫苗 黏膜免疫 同源交换 组胺醇磷酸化酶(hisB) 炭疽杆菌(Bacillus anthracis) 保护性抗原(PA)
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，广泛存在于自然界中，被公认为是安全的食品级（generally regarded as safe，GRAS）微生物。黏膜系统是人体免疫系统的重要组成部分，利用细菌载体接种黏膜表面诱导黏膜和系统水平的有效免疫应答，是有效预防从黏膜入侵传染因子的方法之一。减毒活菌疫苗不适用于所有人群，并有恢复毒力的危险；而用乳酸菌作为活菌疫苗载体能有效的避免以上问题。利用乳酸菌作为活菌疫苗载体能顺利通过胃到达肠黏膜，刺激机体产生免疫反应，有望成为新型疫苗。在乳酸菌中，可以作为活菌疫苗载体有乳杆菌（Lactobacillus）和乳球菌（Lactococcus）。用乳杆菌作为活菌载体表达外源抗原时，可能会产生免疫耐受。而乳球菌不是人体肠道的正常菌，不会产生免疫耐受。国内外有用乳酸菌进行重组蛋白表达和活菌疫苗研究的报道，但缺乏系统研究。国内相关研究较少。用增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）作为报告基因，比较了两种启动子的启动效果。酸诱导启动子P170受到自身代谢产生的H+和生长量的诱导，即在pH低于6.5和在稳定期时诱导表达，不需要额外加入诱导物，宿主菌的菌体生长期和表达蛋白的生产期分开。PnisA启动子是一个诱导效果很强的启动子，受到NisK和NisR的调控。nisin是一种安全的食品添加剂，其作为诱导物时的浓度在一定范围内与外源蛋白表达量呈正比例关系，容易控制。分别将egfp放在P170和PnisA启动子后构建胞内和胞外表达载体，电转化入乳酸乳球菌（Lc．lactis）中，用SDS-PAGE检测及荧光显微镜观察发现无论是胞内表达还是胞外表达，PnisA启动子的启动效果均强于P170启动效果。将pa置于PnisA启动子后构建胞内和胞外表达载体，电转化入Lc．lactis1.2030中。用ELISA检测到PA的胞外表达情况，在培养12小时后检测到PA的表达，在16小时后趋于稳定；Western Blotting检测到胞内PA的表达，用SDS-PAGE检测PA随时间变化的关系，加入诱导物后4小时有表达，在16小时候趋于稳定。胞内表达效果较胞外表达效果好。同时构建了在PA的N端和C端含6个His-tag的表达载体。为了避免抗性基因在体内的转移和质粒的不稳定行，利用组氨醇磷酸化酶基因（hisB）作为同源交换序列，以pMD18-T为基础构建了在Lc．lactis中的自杀型整合载体pHEC。随后将PnisA启动子和pa插入hisB正中间构建了含pa的自杀整合型载体pHEC-Pnis-PA，不含分泌信号肽基因，表达的PA不分泌到胞外。随后筛选得到了单交换突变体Lc．lactis1.2030S和双交换突变体Lc．lactis1.2030D，用SDS-PAGE检测有PA的表达。同样的用乳杆菌表达载体在植物乳杆菌（Lb．plantarum）中表达了N端含有6个his标签的PA。实验结果证实了应用hisB作为同源交换序列将外源基因整合到Lc．lactis染色体DNA的方法构建活菌载体疫苗是可行的。证明了构建的载体在Lc．lactis和Lb．plantarum中表达是可以接受的。以乳酸菌为活菌疫苗载体的策略为抗原在体内的运输提供一种新的途径。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
第一部分 绪论  10-25
  1.1 乳酸菌的定义和分类  10-12
  1.2 乳酸菌的益生作用  12-15
  1.3 乳酸菌与黏膜免疫机制  15-17
  1.4 乳酸菌表达系统研究进展  17-25
第二部分 表达载体的构建及绿色荧光蛋白在乳酸乳球菌中的克隆与表达  25-42
  2.1 材料和方法  26-34
  2.2 结果  34-40
  2.3 讨论  40-42
第三部分 炭疽保护性抗原在乳酸乳球菌中的质粒型克隆与表达  42-56
  3.1 材料和方法  42-46
  3.2 结果  46-54
  3.3 讨论  54-56
第四部分 乳酸乳球菌食品级整合表达系统的构建及炭疽保护性抗原的克隆与表达  56-70
  4.1 材料和方法  56-60
  4.2 结果  60-67
  4.3 讨论  67-70
第五部分 炭疽保护性抗原在植物乳杆菌中的克隆与表达  70-77
  5.1 材料和方法  70-73
  5.2 结果  73-75
  5.3 讨论  75-77
全文总结  77-78
参考文献  78-89
英文缩略语表  89-91
主要溶液的配制  91-95
主要仪器  95-96
博士期间发表论文  96-102
个人简介  102-103
致谢  103

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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