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先天性巨细胞病毒感染致脑发育异常及其机制研究

作　者: 周玉峰
导　师: 方峰
学　校: 华中科技大学
专　业: 儿科学
关键词: 巨细胞病毒神经干细胞胚胎干细胞神经发育脑发育异常 Wnt-1 Ngn1 动物模型细胞模型
分类号: R725.1
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

【研究背景】人巨细胞病毒(HCMV)是导致胎儿中枢神经系统(CNS)损害的首要病因，严重影响儿童生存质量，揭示其神经损伤机制，对防治策略的制定和全面提高人口素质具有重大社会和经济意义。但其发病机制研究成效甚微，原因在于：①巨细胞病毒(CMV)具严格种属特异性，不能建立HCMV感染的动物模型；②CMV是最大的DNA病毒和蛋白嵌合体，其基因动态表达，蛋白种类多、功能复杂；③CMV宫内感染致脑发育异常与发育阶段性密切相关，如何在动态发育的过程中抓住关键时空进行研究也是难点问题。小鼠巨细胞病毒(MCMV)与HCMV具相似生物学特性，其先天性感染的CNS病理表现亦与人相似，且不存在伦理问题，因而成为模拟研究HCMV宫内感染神经损害机制的有效工具。CMV感染所致CNS损伤主要见于胎儿期，既往认为胎儿免疫系统不成熟，不能保护脑组织免受感染是其主要原因。但近年研究发现，CMV对发育中的脑组织有特殊亲嗜性，这与细胞的内在原因有关。因此，CMV感染所致CNS损伤是一种与脑发育有关的疾病，必须在CNS动态发育过程中研究其发病机制。【目的】建立适合整体水平研究CMV先天感染的小鼠模型，观察病毒对不同发育阶段胎脑发育的影响及其CNS损伤的病理特点。进一步利用神经干细胞(NSCs)和胚胎干细胞(ES cells)向神经细胞分化的细胞模型，在体外模拟神经细胞发育过程，在细胞和分子水平上动态研究CMV对ES、NSCs及不同发育阶段神经细胞功能和发育的影响，并探讨其中可能涉及的分子机制，为阐明CMV感染致脑发育异常机制奠定实验和理论基础，为寻找有效防治措施提供新策略。【方法】1 MCMV先天感染小鼠模型建立与整体研究在BALB／c孕鼠孕8d(E8d，孕中期，神经管开始形成)和孕13.5d(E13.5d，孕中后期，神经元形成高峰期)，采用宫内注射法接种含有Lac Z报告基因的MCMV重组毒株RM461(10~4PFU、10~3PFU和10~2PFU)，并以同期注射DMEM细胞培养基的孕鼠作为对照。于E18.5d剖宫取出胎鼠，通过X-gal染色和组织切片分析，观察MCMV接种时妊娠阶段和病毒载量对妊娠结局、胎鼠CNS发育和病理损伤特点的影响。2 MCMV对神经干细胞分化发育细胞模型的影响从E13.5d胎鼠脑组织中分离、培养和鉴定NSCs，建立NSCs向神经细胞分化发育的细胞模型；在MCMV RM461感染后，用X-gal染色监测感染过程，透射电镜观察超微结构改变和病毒颗粒，PCR检测受染细胞和培养上清中病毒DNA，并结合观察培养上清接种到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的细胞病变效应共同评估NSCs对MCMV的易感性和感染状态；采用细胞生长曲线和MTT实验，观察MCMV对NSCs增殖的影响；采用细胞免疫化学和流式细胞术分析Nestin、GFAP、NSE和NF-200表达，探讨MCMV对NSCs分化的影响；采用FITC-Annexin V+PI染色和流式细胞术分析病毒对NSCs凋亡的影响；采用Western blot联合RT-PCR法检测MCMV对NSCs分化相关基因Wnt-1和Ngn1表达的影响。3 MCMV对胚胎干细胞定向分化发育细胞模型的影响以小鼠ES细胞系D3为研究对象，在4-／4+方案诱导ES细胞定向生成神经元的基础上，利用ATRA联合星形胶质细胞高效诱导ES细胞定向生成神经干／前体细胞和神经元；通过形态学观察、畸胎瘤形成实验、碱性磷酸酶染色、RT-PCR检测胚胎干细胞标志Oct-4表达对ES细胞的全能性进行鉴定；用免疫组织化学结合流式细胞术检测ES细胞来源的NSCs的数量和纯度；用分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测；最后利用ES细胞向神经细胞分化的细胞模型探讨MCMV对ES细胞及ES细胞向神经细胞分化的影响。【结果】1 MCMV先天感染模型建立与整体研究1)用宫内注射法成功建立MCMV先天感染小鼠模型：高病毒载量宫内感染极易导致死胎和吸收胎，仅少数胎鼠存活(5.9％)；低病毒载量感染组存活率明显提高(47.1％)，但脑组织病毒阳性率随之下降(12.5％)。10~3PFU为建立MCMV先天感染模型的合适剂量，其存活率和脑组织病毒阳性率分别为27.8％和80％。2)采用10~3PFU病毒载量，E8d宫内注射MCMV组胎鼠的存活率(26.9％)和体重显著低于同期DMEM对照组，而吸收胎率(55.8％)高于对照组；E13.5d宫内注射MCMV组胎鼠存活率(52.0％)低于同期DMEM对照组，而吸收胎率(14.0％)与对照组无明显差异。E8d与E13.5d病毒注射组相比，前者存活率低于后者，而吸收胎率高于后者，且发现小头畸形鼠3例。3) MCMV感染胎鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾等组织X-gal染色呈阳性反应，并且均可分离到病毒，说明该模型是一种全身播散型感染。脑组织X-gal染色显示阳性细胞主要位于脑室管膜下区、海马区和大脑皮层的外周部分。2 MCMV对神经干细胞分化发育的影响1)体外培养的NSCs可在体外连续传代，仍保持球形生长的能力，nestin表达强阳性，可进一步分化NSE、NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。2) MCMV感染NSCs可形成产毒性感染：在感染48h后，细胞出现肿胀，体积增大，神经球边缘的细胞发生脱落和死亡，细胞形态改变随病毒感染复数(MOI)的增加而更加明显；X-gal染色显示，24h受染细胞即可出现阳性改变，48h达高峰；病毒感染72h时，受染细胞及培养上清中MCMV DNA呈阳性，培养上清接种到小鼠MEF细胞后可出现明显细胞病变；电镜下受染细胞胞浆中存在病毒颗粒，细胞器肿胀明显。3) MCMV可明显抑制NSCs的增殖，抑制作用随MOI增加而增强。4)MCMV可明显抑制NSCs的分化：流式细胞仪检测发现，NSCs分化培养2d时感染组和未感染组nestin阳性细胞分别为(62.2±1.8)％和(37.2±2.4)％，差异有极显著性(P＜0.01)；而GFAP阳性细胞比率分别为(37.4±1.6)％和(50.3±1.8)％，NSE阳性细胞比率分别为(8.9±0.8)％和(23.4±1.3)％，差异均有极显著性(P＜0.01)。5)MCMV对NSCs细胞凋亡的影响：MCMV感染组与对照组的早期凋亡率和晚期凋亡率均无明显差异。但感染组细胞死亡率自感染48h始上升，明显高于对照组，至第5d可达(15.2±3.8)％，显著高于对照组的(5.1±0.3)％。6)MCMV感染可抑制Wnt-1和Ngn1的表达：RT-PCR检测发现，感染组Wnt-1基因表达量在12h，24h，48h时低于对照组(P＜0.01)，Ngn1基因表达量在12h，24h，48h，72h时均低于对照组(P＜0.01)；Western blot分析发现，感染组Wnt-1蛋白表达量在24h，48h时低于对照组(P＜0.01)。3 MCMV对胚胎干细胞定向分化发育的影响1)体外培养的小鼠ES细胞-D3在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力，在免疫缺陷鼠体内可形成畸胎瘤；ES细胞AKP染色和Oct-4表达阳性。2) ATRA可促进ES细胞向神经元方向分化：采用4-／4+方案诱导分化的NF-200阳性细胞为(27.3±1.2)％，而未加ATRA对照组(4-／4-)仅为(2.1±0.4)％(P＜0.01)。3) 2-／2+ATRA联合星形胶质细胞(基质诱导细胞)可高效诱导ES细胞分化为神经前体细胞和神经元，最终可诱导形成纯度高达91.4％的nestin阳性细胞；nestin阳性细胞在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞，联合诱导组NF-200和NSE阳性率为(42.7±2.6)％，而2-／2+／4-ATRA对照组阳性率仅为(11.2±1.8)％(P＜0.01)。4) MCMV感染未分化的ES细胞不能形成产毒性感染，但分化的ES细胞可形成产毒性感染；MCMV感染不影响未分化ES细胞的增殖。5) MCMV感染可抑制ES细胞来源的神经元形成，感染组NF-200阳性细胞为(10.2±0.3)％，显著低于对照组的(29.3±0.8)％(P＜0.01)。【结论】1．成功建立了先天性MCMV感染的小鼠模型与NSCs和ES细胞向神经细胞分化的细胞模型，为体内、外探讨CMV先天感染致脑发育机制提供了较为切实可行的、理想的细胞和整体研究模型。2．MCMV先天感染可导致明显的脑发育异常；MCMV对妊娠结局的影响与病毒载量、感染的妊娠阶段有关，小鼠妊娠中期对MCMV的敏感性要高于晚期。3．MCMV可感染体外培养的NSCs，并能形成产毒性感染；MCMV可明显抑制NSCs的增殖、分化并可导致NSCs死亡；MCMV可通过抑制Wnt-1和Ngn1基因表达而影响NSCs分化；MCMV抑制NSCs的增殖与分化可能与先天性CMV感染致脑发育异常有关。4．星形胶质细胞不仅可提高ES来源的NSCs数量，还可促进NSCs向神经元方向分化，利用星形胶质细胞可改善诱导ES生成NSCs的培养体系，此模型可进一步用于体外动态研究神经细胞分化发育机制。5．MCMV不能使未分化的ES细胞形成产毒性感染，未分化的ES细胞对MCMV有一定的抵抗力；ES细胞在分化过程中可获得形成产毒性感染的能力；MCMV感染可抑制ES细胞来源的神经元形成。

全文目录

一符号说明  4-6
二中文摘要  6-11
三英文摘要  11-18
四前言  18-21
五正文  21-93
  第一部分先天性巨细胞病毒感染小鼠模型建立与整体研究  21-38
    1 材料和方法  21-27
    2 结果  27-31
    3 讨论  31-35
    4 照片  35-38
  第二部分小鼠巨细胞病毒对神经干细胞分化发育细胞模型的影响  38-71
    1 材料和方法  38-52
    2 结果  52-61
    3 讨论  61-69
    4 照片  69-71
  第三部分小鼠巨细胞病毒对胚胎干细胞定向分化发育细胞模型的影响  71-93
    1 材料与方法  71-80
    2 结果  80-84
    3 讨论  84-91
    4 照片  91-93
六全文小结  93-94
七参考文献  94-103
八综述/专论  103-119
  1 HCMV免疫逃避分子机制研究进展  103-110
  2 抗病毒药物在儿科的应用  110-119
九附录小鼠胚胎发育与人类胚胎发育对照表  119-121
十博士研究生期间发表论文及获奖励情况  121-122
十一致谢  122

先天性巨细胞病毒感染致脑发育异常及其机制研究

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