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ATF4与正畸牙周组织改建相关的实验研究

作　者: 魏福兰
导　师: 王春玲
学　校: 山东大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 转录活化因子4 离心力人牙周膜细胞口腔正畸学细胞培养
分类号: R783.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

背景和目的在正畸治疗过程中，机械力作用于牙齿，引起牙周组织改建，最终使牙齿发生移动而达到矫治目的。这种正畸治疗的生理介质是牙周膜，它是具有成骨能力的骨／牙界面，是一种变异的骨膜，具有明显的骨吸收和骨形成能力。在正畸临床中，没有牙周膜的粘连牙不能发生移动，这也提示我们，在牙槽骨改建的过程中，牙周膜起到至关重要的作用。正畸牙齿受力后的牙周膜组织表现为受压侧破骨细胞聚集、功能活跃，牙槽骨吸收，受牵张侧成骨细胞生成、行使功能，牙槽骨改建，骨形成。破骨细胞来源于造血组织中的破骨细胞前体，是骨吸收的唯一细胞；成骨细胞来源于牙周膜自身，不仅是骨形成的主要细胞，而且在破骨细胞的附着、促进破骨细胞前体分化和合成破骨细胞骨吸收刺激因子等方面起作用。已有研究证实牙周膜细胞中包含具有分化潜能的成纤维细胞群体，正畸机械力能诱导其表达一些成骨细胞的表型和功能蛋白，向成骨样细胞分化。牙周膜细胞分化为成骨细胞，参与骨吸收和骨形成，是正畸骨改建的关键。牙周膜细胞在机械力作用下向成骨细胞分化的分子机制比较复杂，包含多条信号转导途径。例如，一氧化氮(NO)、前列腺素12(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)、百日咳毒素敏感异源三聚体G蛋白(PTX-敏感蛋白)、动力敏感钙离子通道等。近年的研究表明，一些核内转录因子也参与了细胞内调控途径，将细胞外物理或机械刺激转化为协调的细胞反应。1987年，能以一个共同的核心序列(CGTCA)和腺病毒启动子E2，E3和E4结合的蛋白被命名为ATF，在随后的几年中发现了大量相同的或者类似的能和ATF／CRE位点结合的蛋白，这些蛋白都含有一个命名为bZip的DNA结合区域。基于他们的氨基酸的相似性，ATF家族被分为ATF2，ATF4，ATF6，B-ATF亚类。1989年，Hai根据ATF／CREB结合序列特异性识别位点，首次克隆了ATF4。其他的学者也相继分离出了ATF4，它通常又被称为TAXREB67、CREB2或C／ATF。研究表明，ATF4与成骨细胞特异性基因骨钙素启动区的成骨细胞特异性元件1(OSE1)相结合，调控成骨细胞的分化。至今为止，只有Runx2和ATF4可诱导非成骨细胞系表达成骨细胞特异型基因骨钙素的表达。另外，有研究证实ATF4是RSK2的磷酸化底物，ATF4(-／-)鼠出现CLS表现型，除精神发育迟缓外，还伴有颅面、牙齿、骨骼发育异常。ATF4和RSK2以一种线性级联的方式调控成骨细胞分化和功能，是间充质细胞向成骨细胞分化所必需的。ATF4作为成骨细胞分化的关键因子，与骨发育和牙齿发育关系的研究正在不断开展。但正畸骨改建与骨发育是两种不同的生理过程，ATF4在正畸牙齿移动牙周组织的表达和分布，在机械力的作用下体外培养的人牙周膜细胞中表达变化的情况，以及在牙周膜细胞向成骨样细胞分化的过程中所起的作用，国内外尚未有报道。本研究通过建立正畸大鼠牙齿移动动物模型和体外细胞培养，结合细胞力学试验方法和分子生物学测试技术，拟从组织、细胞水平以及分子生物学角度探讨ATF4在正畸牙齿移动过程中对牙周组织改建的影响及作用机制，进一步为正畸牙齿移动提供理论和实践依据。方法1．观察正畸牙周组织改建过程中ATF4的表达变化建立大鼠牙齿移动实验模型，在加力1h，2h，4h，8h，12h，1d，3d，5d，7d后，处死大鼠，固定，脱钙，制作大鼠第一磨牙牙周组织石蜡切片，HE染色观察牙周组织形态学变化，免疫组化进行半定量分析ATF4的表达。2．观察机械力加载下人牙周膜细胞ATF4mRNA和蛋白的表达变化组织块法培养原代人牙周膜细胞，并做波形丝蛋白抗体和角蛋白抗体染色鉴定。取4-6代生长旺盛，性质稳定的人牙周膜细胞进行实验。以2.5×10~5／孔将第4代人牙周膜细胞接种于6孔细胞培养板培养24小时，换用含2％胎牛血清的条件培养基继续培养24小时，将六孔板置于离心加力支架中，离心机加力10min，30min，60min，90min，120min，240min(910rev／min，约167g相对离心力)。提取总RNA和核蛋白，以半定量RT-PCR和Western Blotting检测ATF4mRNA和蛋白的表达变化。3．观察ATF4在牙周膜细胞向成骨样细胞分化过程中的作用5％CO2，37℃条件下，生长状态良好的4-6代人牙周膜细胞培养于10％胎牛血清的DMEM培养基。按阳离子脂质体Lipofectamine 2000TM说明操作，用美国肿瘤研究所Professor Lee惠赠的重组质粒pMyc-ATF4和空载体质粒pCMV5-myc转染人牙周膜细胞。半定量RT-PCR和Western Blotting检测未转染细胞、转染空质粒(pCMV5-myc)细胞、转染目的基因(pMyc-ATF4)细胞ATF4mRNA和蛋白表达水平。三组细胞均加载30min 167g离心力，检测ALP活性及成骨样基因骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、胶原Ⅰ(COLI)、骨涎蛋白(BSP)基因的表达变化。结果1．正常大鼠的牙周组织中基本上未见有明显的ATF4的阳性表达，靠近牙骨质和牙槽骨表面的牙周膜部分轻度染色，而中间部分的牙周膜染色更浅。正畸加力组大鼠牙周组织中ATF4表达增强，表达贯穿正畸牙周组织改建的全过程。在压力侧，靠近牙骨质表面的牙周膜强阳性表达；在张力侧，靠近牙骨质和牙槽骨表面的牙周膜区域强阳性表达，中间部分的牙周膜也阳性表达；所有加力组大鼠张力区比压力区阳性染色深，骨形成区域阳性染色较强。2．正常人牙周膜细胞有ATF4 mRNA表达；加载167g离心力后，ATF4 mR2NA表达发生变化：加力10min时开始增加，但无统计学意义(P＞0.05)；加力30min时达到高峰(P＜0.01)；加力60min，90min时表达开始下降，但仍高于加力前水平(P＜0.01)；加力120min时降至加力前水平(P＞0.05)。正常人牙周膜细胞ATF4蛋白表达很低；加载167g离心力后，ATF4蛋白表达发生变化：加力10min时开始增加，但无统计学意义(P＞0.05)；加力30min时继续增加(P＜0.01)；加力60min时达到高峰(P＜0.01)，加力90min时表达开始下降，但仍高于加力前水平(P＜0.01)；加力120min时降至加力前水平(P＞0.05)。3．人牙周膜细胞表达ALP，转染目的基因pMyc-ATF4后，ALP表达活性升高(P＜0.05)，但转染空质粒pCMV5-myc ALP表达未发生明显变化(NS：P＞0.05)。未转染、转染pCMV5-myc、转染pMyc-ATF4人牙周膜细胞受到167g离心力，ALP表达均升高(*P＜0.05，**P＜0.01)；但转染pCMV5-myc与未转染细胞相比，受力后ALP表达无明显差异(NS：P＞0.05)，转染pMyc-ATF4与未转染细胞相比，受力后ALP表达升高(P＜0.01)。人牙周膜细胞有OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA表达，没有OCNmRNA表达。转染目的基因pMyc-ATF4后，OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表达均升高(*P＜0.05，**P＜0.01)，但转染空质粒pCMV5-myc后，OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表达未发生明显变化(NS：P＞0.05)。未转染、转染pCMV5-myc、转染pMyc-ATF4细胞受到167g离心力，OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表达均升高(*P＜0.05，**P＜0.01)；但转染pCMV5-myc与未转染细胞相比，受力后OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表达无明显差异(NS：P＞0.05)，转染pMyc-ATF4与未转染细胞相比，受力后OPNmRNA、COLImRNA、BSPmRNA、OCNmRNA表达升高(P＜0.01)。结论1．ATF4在正畸牙齿移动过程中的表达有明显的变化，从而确定其参与了牙齿移动过程中的牙周组织的改建，在正畸牙齿移动的机制中具有重要意义。2．应力刺激可使ATF4mRNA及蛋白的表达增强，表达量在30分钟到60分钟左右达到峰值，随后逐渐降低至正常水平；表明ATF4可对力学刺激作出快速、一过性的短暂表达反应。从细胞水平证实ATF4参与了正畸牙齿移动牙周组织的改建。3．ATF4可促进加载下的人牙周膜细胞向成骨细胞分化。4．此研究有助于更好地理解牙齿移动中的牙周组织改建的机理，并由此指导临床实践。

全文目录

中文摘要  6-10
英文摘要  10-15
符号说明  15-16
前言  16-22
  参考文献  19-22
第一部分大鼠正畸牙齿移动过程中ATF4的表达和意义  22-31
  材料与方法  22-25
  结果  25-26
  讨论  26-28
  小结  28-29
  参考文献  29-31
第二部分人牙周膜细胞在正畸力作用下ATF4 mRNA和蛋白的表达变化  31-53
  材料与方法  31-43
  结果  43-44
  讨论  44-48
  小结  48-49
  参考文献  49-53
第三部分 ATF4在牙周膜细胞向成骨样细胞分化过程中的作用  53-69
  材料与方法  53-57
  结果  57-59
  讨论  59-63
  小结  63-64
  参考文献  64-69
综述  69-81
附图表  81-95
致谢  95-96
个人简历  96-99
外文论文  99-131
l喻床病例  131-146
学位论文评阅及答辩情况表  146

ATF4与正畸牙周组织改建相关的实验研究

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