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新生大鼠耳蜗高增殖细胞的研究及新霉素对耳蜗nestin表达的影响

作　者: 江红群
导　师: 王正敏；李华伟
学　校: 复旦大学
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 干细胞／祖细胞毛细胞再生增生分化细胞培养细胞分裂生长因子超微结构基底膜耳蜗
分类号: R764
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

第一部分新生大鼠耳蜗高增殖细胞的研究目的：1．研究新生大鼠耳蜗内是否有高增殖细胞，以及该高增殖细胞能够分化为哪些类型的细胞。同时探讨纤维粘连蛋白，多聚鸟氨酸及多聚赖氨酸对高增殖细胞球贴壁及生长的影响。2．观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对耳蜗高增殖细胞的影响。3。观察耳蜗高增殖细胞的超微结构。以期为利用耳蜗高增殖细胞进行细胞移植治疗感音神经性耳聋提供实验依据。方法：1．分离P1～3 SD大鼠耳蜗基底膜，制成单细胞悬液，在无血清培养液中培养，形成细胞球后，接种于不同基质(纤维粘连蛋白，多聚鸟氨酸及多聚赖氨酸)包被的盖玻片上贴壁分化，观察细胞球的贴壁及生长情况，同时对贴壁16小时的细胞球计数，数据进行统计学分析。通过BrdU掺入实验，检测细胞的增殖状态；通过免疫组化荧光染色方法，鉴定细胞球及其分化细胞的性质。2．在无血清培养液中添加EGF或／和bFGF，培养7天后，进行细胞球计数，比较二种生长因子对细胞球生长的影响。3．对细胞球及贴壁分化细胞进行透射和扫描电镜观察，了解其超微结构。结果：1．在上述条件下培养的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的细胞球，细胞球内90％细胞呈5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-demoxyuridine，BrdU)染色阳性，并且球内细胞巢蛋白(nestin)染色阳性；对细胞球贴壁后分化的细胞行免疫细胞化学荧光染色鉴定，可见①肌球蛋白7A(myosin7A)、espin、myosin7A+鬼笔环肽(phalloidin)、myosin7A+BrdU，espin+BrdU阳性表达的细胞，表现为毛细胞的特征；②神经丝蛋白-M(neurofilament-M，NF-M)、微管蛋白-β-Ⅲ(tubulin-β-Ⅲ)、nestin以及NF-M+BrdU阳性表达的细胞，表现为神经元特征；③胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)阳性表达的细胞，表现为支持细胞或星形胶质细胞的特征。2．在纤维粘连蛋白、多聚鸟氨酸及多聚赖氨酸包被的玻片上，每张玻片平均贴壁的细胞数分别为：44.12±8.04，11±2.10，7.33±1.51。纤维粘连蛋白与多聚鸟氨酸和多聚赖氨酸之间的差异极为显著，而多聚鸟氨酸与多聚赖氨酸之间的差异无统计学意义。3．单个耳蜗平均可培养出45.25±22.95个细胞球，培养液中添加bFGF或／和EGF可以明显增加细胞球的数量，并具有统计学意义。4．扫描电镜显示细胞球内细胞呈圆球形，大小均匀一致，表面具有众多短而细的微绒毛样突起，无数球形的细胞彼此黏附在一起；透射电镜显示细胞球内细胞排列紧密，之间可见紧密连接、桥粒和缝隙连接，细胞体积小，胞核大。细胞球内细胞表面具有众多的微绒毛样结构，胞浆内有丰富的内质网、微管、微丝和线粒体等细胞骨架结构和细胞器。贴壁分化细胞扫描电镜显示细胞表面具有众多短而细的微绒毛样突起。结论：1．新生SD大鼠耳蜗内存在一种具有高增殖能力的细胞，可以分化为具有纤毛样结构的毛细胞、神经元、神经胶质细胞或支持细胞。2．纤维粘连蛋白有利于高增殖细胞球的贴壁与生长。3．平均单个新生SD大鼠耳蜗可培养出45.25±22.95个高增殖细胞球。EGF或／和bFGF均可诱导耳蜗内高增殖细胞形成细胞球。3．耳蜗高增殖细胞的超微结构显示早期幼稚细胞发育的特征。第二部分新霉素对大鼠耳蜗nestin表达的影响目的：研究nestin在正常及新霉素致损大鼠耳蜗感觉上皮细胞及螺旋神经节神经元表达的变化，以期了解新霉素对大鼠耳蜗nestin表达的影响。方法：1．取正常不同年龄(P1、P14、P30、P60)的SD大鼠耳蜗行免疫组化染色，观察耳蜗各圈感觉上皮及螺旋神经节神经元nestin表达的变化；2．12只7天龄SD大鼠随机分成实验组及对照组：实验组连续皮下注射新霉素共12天，对照组注射等量的生理盐水，分别于停药后的第1天和第14天，处死动物，取出耳蜗，进行免疫组化荧光染色，观察耳蜗各圈感觉上皮及螺旋神经节神经元nestin与GFAP表达的变化。结果：1．在正常P1大鼠耳蜗之感觉上皮可见nestin阳性表达，顶圈细胞表达nestin免疫反应最强，其次为中圈，底圈最弱；不仅支持细胞表达nestin，而且内毛细胞和外毛细胞也表达nestin；在P30大鼠，感觉上皮细胞表达nestin明显减弱，至P60大鼠，感觉上皮细胞nestin的表达消失。2．在正常P1及P14大鼠，耳蜗各圈螺旋神经节神经元表达nestin阳性，其中顶圈表达nestin免疫反应最强，在P30大鼠，各圈螺旋神经节神经元表达nestin减弱，但在P60大鼠，仍可见螺旋神经节神经元表达nestin。3．与对照组比较，实验组耳蜗感觉上皮细胞在停药后第1天，nestin的表达消失，停药后第14天，仍无nestin表达阳性细胞出现；4．与对照组比较，实验组耳蜗螺旋神经节神经元在停药后第14天，nestin的表达减弱，但仍存在。5．停药后第14天，对照组与实验组鼠耳蜗感觉上皮均见GFAP表达，两组之间无差异，但在螺旋神经节神经元均未见GFAP表达。结论：1．Nestin在出生后大鼠耳蜗感觉上皮及螺旋神经元均有表达，并且随耳蜗发育成熟而表达减弱；2．新霉素致损后，耳蜗感觉上皮细胞与螺旋神经节神经元nestin的表达减弱，但感觉上皮GFAP的表达无明显变化。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
第一部分新生大鼠耳蜗高增殖细胞的研究  10-42
  前言  10-13
  实验一新生大鼠耳蜗高增殖细胞的培养与鉴定  13-29
    材料与方法  13-17
    结果  17-25
    讨论  25-29
  实验二 EGF和bFGF对新生大鼠耳蜗高增殖细胞球的影响  29-35
    材料与方法  29-30
    结果  30-33
    讨论  33-35
  实验三新生大鼠耳蜗高增殖细胞球及其分化细胞的超微结构观察  35-42
    材料与方法  35-37
    结果  37-41
    讨论  41-42
第二部分新霉素对大鼠耳蜗nestin表达的影响  42-56
  前言  42-44
  实验一 nestin在出生后大鼠耳蜗表达的增龄变化  44-51
    材料与方法  44-45
    结果  45-49
    讨论  49-51
  实验二新霉素致损后大鼠耳蜗nestin表达的变化  51-56
    材料与方法  51-52
    结果  52-55
    讨论  55-56
全文小结  56-57
中英文索引  57-58
参考文献  58-67
综述一干细胞与感音神经性耳聋  67-72
综述二中间丝蛋白及其内耳研究进展  72-81
附录博士研究生期间发表的论文  81-82
致谢  82-83

新生大鼠耳蜗高增殖细胞的研究及新霉素对耳蜗nestin表达的影响

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