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信号增强电化学免疫分析法研究

作　者: 陈兆鹏
导　师: 俞汝勤；沈国励
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 免疫传感器免疫分析电化学免疫分析法荧光免疫分析法双电极信号转换系统纳米粒子
分类号: O657.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

免疫分析信号的增强技术一直以来是免疫分析领域研究的一个重要方面,它对于提高分析的灵敏度有着至关重要的意义。电化学仪器具有简便、灵敏、易于微型化等优点。因此,开发新的电化学信号增强免疫分析技术无疑可以推动免疫分析的发展。为此,本文在增强免疫分析信号尤其是电化学免疫分析信号方面做了一下工作:1.提出了一种基于直接吸附蛋白质于多孔纳米金膜表面的免疫传感器。在这种方法中,我们通过在-0.5 V(vs. Ag/AgCl)电解0.08 M氯金酸和0.004 M乙酸铅的混合溶液在玻碳电极表面得到一层多孔纳米金膜,并将羊抗人IgG抗体吸附于纳米金膜表面,在夹心免疫反应完成后,利用辣根过氧化物酶催化底物生成不溶物并吸附于电极表面,由于不溶物的吸附,使得电子转移阻抗大大增加。这种放大了的阻抗信号与人IgG的浓度在0.011~11 ng/ml范围内成线性关系,检测限为0.009 ng/ml。2.提出了一种基于生物催化金属沉积结合阳极溶出伏安检测的电化学放大免疫分析法。在这种方法中,抗体首先通过一层自组装膜而被固定于金电极表面。夹心免疫反应后,碱性磷酸酯酶标记的抗体被捕捉于电极表面。碱性磷酸酯酶催化抗坏血酸磷酸酯水解成抗坏血酸,生成的抗坏血酸将银离子还原并沉积在蛋白质修饰过的电极表面。然后通过电化学法将银氧化溶出并用阳极溶出伏安法来检测溶出的银离子。和用直接伏安法检测催化生成抗坏血酸相比,用阳极溶出伏安法检测金属离子更为灵敏。因为沉积的银与酶催化生成的抗坏血酸的量有关,而抗坏血酸的量又取决于连接在电极上的酶的量,所以溶出峰电流的大小与目标抗原的量相关。这种结合了酶的催化放大作用和阳极溶出伏安法检测金属离子的高灵敏度的免疫分析法显著地提高了分析的灵敏度。3.提出了一种基于双电极转换系统作为信号放大装置的电化学免疫分析法。这种装置由两个用盐桥连接起来的电解池,一个免疫电极,一个检测电极以及连结于它们之间的导线组成。吸附有抗体的免疫电极在发生夹心免疫反应后,被作为阳极置于酶反应液中,另外一支检测电极置于银沉积液,免疫电极表面的碱性磷酸酶催化磷酸抗坏血酸酯水解生成抗坏血酸,生成的抗坏血酸通过这种装置被在阴极区的银离子氧化,使得单质银被沉积于检测电极表面,经过30分钟的酶催化反应,大量的金属银便沉积于电极表面。由于酶的催化产物是在产生的同时,就被银离子氧化,基本上不会因催化产物扩散到溶液中而使分析信号受到损失。通过阳极溶出法直接检测电极表面的沉积银的量,可以大大提高分析的灵敏度,同在同一支电极上的化学沉积法相比,这种将酶催化反应和金属沉积过程分在两个不同的电解池中的电化学法避免了因金属沉积于蛋白质表面对酶的活性的影响。4.提出了一种基于辣根过氧化物酶(HRP)对银沉积的抑制作用的新型电化学信号放大免疫分析法。在这种方法中,抗体首先通过一层自组装膜而固定在金电极上,经过夹心免疫反应后,使HRP酶也结合在电极表面。当有过氧化氢(H2O2)存在时,HRP酶抑制了对苯二酚还原银离子在电极表面沉积为单质银的过程。我们采用了线性扫描伏安法检测电极表面沉积的银的量,结果表明银的溶出峰电流与人免疫球蛋白IgG的浓度在50-2500 ng/mL范围内成线性关系,检测下限为35 ng/mL。5.提出了一种基于生物催化沉积金属纳米粒子并结合金属纳米粒子继续催化金属沉积使它本身增大的信号连续放大电化学免疫分析法。我们先将羊抗人抗体吸附于聚苯乙烯微孔板上,在免疫反应及催化沉积完成后,将微孔板内的金属溶解,采用溶出伏安法测定溶解的金属离子。由于这种方法结合了酶的催化作用及金属纳米粒子的催化作用进行连续放大,分析的灵敏度得到了显著地提高。溶出峰电流与人IgG的浓度在0.1~10 ng/ml范围内成线性关系。显然,这种这种利用了酶的高催化活性及纳米粒子催化作用的方法在提高免疫分析的灵敏度方面有着广阔的应用前景。6.提出了一种以纳米金作为电化学标记物的免疫传感器。在这种方法中,抗体首先通过被动吸附而固定于碳糊电极的表面,接着定量结合抗原和纳米金标记的抗体以形成免疫夹心复合物。为了检测结合在电极表面的纳米金的量,先以电化学法氧化纳米金生成AuCl4-离子,然后采用吸附伏安法定量检测吸附在电极表面的AuCl4-离子。峰电流与抗原(人IgG)浓度在10到500 ng/ml范围内成线性关系,其检测下限为4.0 ng/ml。7.除了对信号增强电化学免疫分析法本身的研究之外,我们运用电化学及其它手段研究提出了一种新型、简便、灵敏的荧光免疫分析方法。这种方法基于夹心异相免疫分析,并利用了纳米颗粒标记的抗体可以产生荧光淬灭的特性。羊抗人IgG首先吸附在微孔板上,接着人IgG被羊抗人IgG捕捉结合,再被纳米金标记的抗体夹心形成免疫复合物。然后加入氢氧化钠和柠檬酸三钠的混合溶液解离免疫复合物,获得的含有纳米金标记抗体的溶液用于进行荧光淬灭分析。在517 nm处激发的荧光素的荧光强度与人IgG的浓度成反对数线性关系,其检测范围是10到5000 ng/mL,检测下限是4.7 ng/mL。同时我们也用电化学实验和可见紫外检测分别验证了纳米金标记的抗体是否解离完全以及解离后是否团聚。这个方法可以延伸扩展至检测其他目标分子如DNA链和其他抗原,而且在临床诊断上有着广阔的应用前景。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-12
名词注释表  12-16
第1章绪论  16-35
  1.1 免疫分析法概述  16-25
    1.1.1 抗原的概念  16
    1.1.2 抗体概念及基本结构  16-17
    1.1.3 抗原与抗体反应  17
    1.1.4 免疫分析中的抗体位点占据原理  17-18
    1.1.5 免疫分析法的分类  18-19
    1.1.6 免疫分析的研究进展  19-25
  1.2 免疫分析信号的增强  25-32
    1.2.1 酶催化信号增强法  25-28
    1.2.2 生物金属化法  28-29
    1.2.3 纳米粒子标记增强法  29-32
  1.3 电化学免疫分析展望  32-33
  1.4 本论文研究工作的构思  33-35
第2章基于多孔纳米金膜直接吸附蛋白质的阻抗型免疫传感器  35-43
  2.1 引言  35-36
  2.2 实验部分  36-37
    2.2.1 仪器与试剂  36
    2.2.2 免疫传感器的制备及免疫信号放大  36-37
  2.3 结果与讨论  37-42
    2.3.1 电极表面表征  37
    2.3.2 电化学特征  37-40
    2.3.3 实验条件的优化  40-42
    2.3.4 非特异性吸附的影响  42
    2.3.5 工作曲线  42
  2.4 小结  42-43
第3章一种基于生物催化金属沉积结合阳极溶出伏安检测的电化学放大免疫分析法  43-50
  3.1 引言  43-44
  3.2 实验部分  44-45
    3.2.1 仪器和试剂  44
    3.2.2 金电极的修饰  44
    3.2.3 分析过程  44-45
  3.3 结果与讨论  45-49
    3.3.1 阳极溶出伏安实验  45-46
    3.3.2 实验条件的优化  46-48
    3.3.3 非特异性吸附考察  48
    3.3.4 人IgG 的分析结果  48-49
  3.4 小结  49-50
第4章建立在双电极信号转换系统上的电化学信号放大免疫分析法  50-57
  4.1 引言  50-51
  4.2 实验部分  51-52
    4.2.1 仪器与试剂  51
    4.2.2 免疫分析过程  51-52
  4.3 结果与讨论  52-55
    4.3.1 原理及试验现象  52-53
    4.3.2 分析条件的优化  53-55
    4.3.3 人IgG 的检测  55
  4.4 小结  55-57
第5章基于辣根过氧化物酶标记蛋白对银沉积抑制作用的电化学信号放大免疫分析法  57-61
  5.1 引言  57
  5.2 实验部分  57-59
    5.2.1 仪器与试剂  57-58
    5.2.2 免疫分析过程  58-59
  5.3 结果与讨论  59-60
  5.4 小结  60-61
第6章基于生物金属化及银增强连续放大的电化学免疫分析法  61-68
  6.1 引言  61-62
  6.2 实验部分  62-63
    6.2.1 仪器与试剂  62
    6.2.2 实验过程  62-63
  6.3 结果与讨论  63-67
    6.3.1 实验条件的优化  63-66
    6.3.2 非特异性吸附考察  66
    6.3.3 人IgG 的分析结果  66-67
  6.4 小结  67-68
第7章一种以纳米金为电活性探针的免疫分析法研究  68-75
  7.1 引言  68
  7.2 实验部分  68-70
    7.2.1 仪器与试剂  68-69
    7.2.2 纳米金的制备及标记抗体  69
    7.2.3 碳糊电极的制备  69
    7.2.4 碳糊电极的电化学预处理和抗体在电极上的吸附  69
    7.2.5 免疫分析过程  69
    7.2.6 纳米金的电化学氧化与信号记录  69-70
  7.3 结果与讨论  70-74
    7.3.1 实验条件的优化  70-72
    7.3.2 非特异性吸附的影响  72-73
    7.3.3 人IgG 的检测  73-74
  7.4 小结  74-75
第8章一种基于碱液分离纳米金免疫复合物的荧光淬灭免疫分析法  75-82
  8.1 引言  75-76
  8.2 实验部分  76-77
    8.2.1 仪器与试剂  76
    8.2.2 纳米金的合成  76
    8.2.3 金标抗体的制备  76-77
    8.2.4 免疫分析和荧光检测  77
  8.3 结果与讨论  77-81
    8.3.1 溶出伏安实验  77-78
    8.3.2 紫外-可见吸收光谱实验  78-80
    8.3.3 人IgG 的分析结果  80-81
  8.4 小结  81-82
结论  82-84
参考文献  84-98
附录A 攻读学位期间所完成的学术论文  98-99
致谢  99

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