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香蕉果皮带毛和早花突变体的筛选、鉴定及突变机理初步研究

作　者: 徐立
导　师: 黄俊生
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 香蕉突变体表皮毛早花突变机理
分类号: S668.1
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

香蕉是世界重要水果之一,世界第四大粮食作物,近5亿人口的主要粮食。香蕉在我国热带亚热带的农业生产中占据重要地位。但由于香蕉栽培品种多为三倍体,杂交育种困难,香蕉新品种的选育工作一直是困扰世界的难题,而有关香蕉育种基础理论的研究更是有限,长期以来,突变育种是香蕉育种的主要途径之一。香蕉果皮带毛嵌合体是“巴西”香蕉中的突变单株,其花梗、果实、雄花苞片等部位均表现有毛-无毛的嵌合特征。以此嵌合体的吸芽为外植体,经过组织培养获得果皮完全带毛、嵌合和无毛的后代,继续以完全带毛植株的吸芽进行组织培养,经过4年的分离和筛选,从香蕉果皮带毛嵌合体分离出稳定的香蕉早花/果皮带毛突变体株系。香蕉早花/果皮带毛突变体在植株形态、果实品质等方面与“巴西”香蕉没有明显差异,但果皮、果柄、苞片和苞片脱落处的疤痕上部都覆盖表皮毛,生长周期比“巴西”香蕉缩短至少3个月,植株相对矮化,产量降低;香蕉突变体果皮上不规则分布着两种表皮毛:长表皮毛和短表皮毛。长表皮毛长度约0.17～0.37mm,密度为16cm-2左右;短表皮毛长度为0.02～0.07mm,密度约190cm-2,这两种类型的表皮毛均为柱型,没有分叉,顶端膨大为半球形。突变体尾蕉上还存在分叉、气球形、葫芦形和2～9节不等的念珠状等多种类型的表皮毛。同一时期,不同部位果皮(子房皮)上的表皮毛发育程度不同,越靠近果束末端,表皮毛的发育越晚,在第49束子房表皮上仅能观察到很小的极少量的突起。当果实接近成熟时,果实上的表皮毛萎缩,部分表皮毛脱落。同时,突变体果束上蓟马的密度比“巴西”低,果皮上蓟马刺伤产生的疤痕也明显少于“巴西”香蕉。利用ISSR和SSR技术对突变体和“巴西”香蕉的基因组DNA进行分析,结果表明两种方法都能显示两者之间的多态性,但数量较少。提取高质量的“巴西”田间叶片、突变体田间叶片和突变体组培苗叶片的基因组DNA,采用包括EcoRI/MseI双酶切、加接头、预扩增和选择性扩增等程序的AFLP技术,在64对E+3/M+3引物中有6对引物扩增出8条多态性片段,4条来自“巴西”香蕉,4条来自突变体;多态性发生在“巴西”香蕉和突变体(田间/组培苗)之间,而突变体田间植株和组培苗之间没有多态性。对AFLP多态片段进行序列分析后发现,8个片段都仅存在很小的阅读框架;其中5个片段存在转录起始因子的结合位点CAAT box,2个片段存在MYB转录因子的结合序列TATCCAY(T/C)motif,1个具有启动子特征的片段还存在果实/种子特异的保守序列TGTCACA、AACAAAC和CATGCA。提取“巴西”和突变体香蕉组培苗叶片的RNA,分离纯化mRNA后,合成cDNA

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
1 前言  11-25
  1.1 国内外香蕉生产及常规选育种进展  11-13
  1.2 香蕉突变体育种  13-16
  1.3 香蕉突变体育种的局限性  16-17
  1.4 植物表皮毛发育  17-18
  1.5 分子标记技术与香蕉育种  18-21
    1.5.1 ISSR 与 SSR 技术  18-19
    1.5.2 AFLP 技术  19-21
  1.6 cDNA-AFLP 与功能基因表达  21-23
  1.7 本研究的目的和意义  23-25
2 材料与方法  25-38
  2.1 实验材料  25
  2.2 实验方法  25-38
    2.2.1 香蕉突变体的分离  25-26
      2.2.1.1 筛选方法  25
      2.2.1.2 香蕉组织培养条件  25
      2.2.1.3 香蕉离体快繁的过程  25
      2.2.1.4 香蕉组织培养所用培养基配方  25-26
      2.2.1.5 香蕉组培苗移栽及栽培  26
    2.2.2 突变体植株描述及综合评价  26
      2.2.2.1 植株描述  26
      2.2.2.2 果肉硬度和果皮厚度的测定  26
      2.2.2.3 可溶性固形物、固/酸比的测定  26
      2.2.2.4 矿质元素测定  26
      2.2.2.5 抗蓟马性状调查  26
    2.2.3 果实表皮形态观察  26-27
      2.2.3.1 电镜扫描  26
      2.2.3.2 数码体视镜观察  26-27
      2.2.3.3 石蜡切片与显微观察  27
    2.2.4 基因组 DNA 提取  27-28
    2.2.5 RNA 提取  28
    2.2.6 ISSR  28-29
      2.2.6.1 优化后的 ISSR PCR 反应体系  28
      2.2.6.2 ISSR PCR 反应程序  28-29
    2.2.7 SSR  29
      2.2.7.1 优化后的 SSR PCR 反应体系  29
      2.2.7.2 SSR PCR 反应程序  29
    2.2.8 AFLP  29-30
      2.2.8.1 基因组 DNA 酶解  29
      2.2.8.2 酶解产物加接头  29
      2.2.8.3 预扩增  29-30
      2.2.8.4 选择性扩增  30
    2.2.9 cDNA－AFLP  30-34
      2.2.9.1 mRNA 的分离  30-31
      2.2.9.2 cDNA 一链的合成  31-32
      2.2.9.3 双链cDNA 合成  32
      2.2.9.4 双链cDNA 酶解  32-33
      2.2.9.5 接头准备  33
      2.2.9.6 加接头  33
      2.2.9.7 预扩增  33
      2.2.9.8 选择性扩增  33-34
    2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳  34-35
      2.2.10.1 安装电泳装置（BioRad）  34
      2.2.10.2 制备6%凝胶溶液和灌胶  34
      2.2.10.3 安装测序胶  34-35
      2.2.10.4 上样和电泳  35
      2.2.10.5 聚丙烯酰胺凝胶染色  35
    2.2.11 目的片段的回收  35
    2.2.12 目的片段的克隆与序列测定  35-37
      2.2.12.1 大肠杆菌感受态的制备  35-36
      2.2.12.2 DNA 片段与 TA 克隆载体的连接  36
      2.2.12.3 连接产物转化大肠杆菌  36
      2.2.12.4 质粒的提取  36-37
      2.2.12.5 质粒的酶切鉴定  37
      2.2.12.6 序列测定  37
    2.2.13 核酸序列的分析  37-38
      2.2.13.1 DNA 序列分析  37
      2.2.13.2 cDNA 序列分析  37-38
3 结果与分析  38-70
  3.1 香蕉果皮带毛突变体的分离  38
  3.2 突变体植株描述及其综合评价  38-45
    3.2.1 突变体与“巴西”香蕉形态特征比较  38-44
    3.2.2 突变体与“巴西”香蕉果实品质的比较  44-45
      3.2.2.1 果肉糖酸含量、硬度和可溶性固形物  44
      3.2.2.2 矿质元素含量  44-45
  3.3 突变体表皮形态  45-56
    3.3.1 嵌合体表皮形态特征  45
    3.3.2 突变体不同部位幼果表皮形态特征  45-49
    3.3.3 突变体同一果实不同部位表皮毛的分布  49-52
    3.3.4 果皮带毛突变体与“巴西”中期和后期果实表皮形态比较  52-53
    3.3.5 突变体表皮毛的形态类型  53-56
  3.4 香蕉突变体和野生型 DNA 多态性分析  56-65
    3.4.1 突变体香蕉和“巴西”香蕉的 ISSR 分析  56
    3.4.2 突变体香蕉和“巴西”香蕉的 SSR 分析  56-58
    3.4.3 突变体香蕉和“巴西”香蕉的 AFLP 分析  58-65
      3.4.3.1 香蕉基因组 DNA 的制备  58
      3.4.3.2 DNA EcoRI/MseI 双酶解及接头的连接  58-59
      3.4.3.3 预扩增  59
      3.4.3.4 选择性扩增  59-61
      3.4.3.5 多态片段的回收、克隆  61
      3.4.3.6 重组质粒的酶切鉴定  61-62
      3.4.3.7 AFLP 多态片段的序列定  62-64
      3.4.3.8 多态片段的序列分析  64-65
  3.5 香蕉突变体和野生型基因表达差异的分析  65-70
    3.5.1 总 RNA 提取和mRNA 的分离  65-66
    3.5.2 双链cDNA 合成  66
    3.5.3 cDNA-AFLP 分析  66-68
    3.5.4 差异片段的序列测定及分析  68-70
4 讨论  70-78
  4.1 植物嵌合体与新品种选育  70
  4.2 植物表皮毛的功能与作用  70-72
  4.3 分子标记技术与香蕉种质鉴定、分类  72-73
  4.4 植物遗传变异与基因表达分析  73-78
5 结论  78-79
参考文献  79-92
缩略语表  92-94
附录 1 主要试剂的配制  94-97
附录 2 ISSR 引物序列  97-98
附录 3 SSR 引物序列  98-99
附录 4 香蕉 AFLP 和cDNA-AFLP 选择性扩增引物组合及扩增情况  99-100
附录 5 cDNA-AFLP 差异序列中具有同源基因的片段  100-103
博士期间相关的研究成果与发表论文  103-104
致谢  104-105
中文详细摘要  105-110

香蕉果皮带毛和早花突变体的筛选、鉴定及突变机理初步研究

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