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Follistatin基因在牙鲆胚胎中的表达及其在肌肉发育中作用的研究

作　者: 刘庆华
导　师: 张培军
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物
关键词: 牙鲆 Paralichthys olivaceus Follistatin 胚胎发育肌肉原位杂交显微注射
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽。FS对不同类型的细胞有广泛的调节作用,具有多方面的生物学作用。本研究克隆到牙鲆Follistatin基因,并利用RT-PCR和原位杂交对其在胚胎及成体中的表达进行了分析,并对其启动子进行了组织特异性分析。1. Follistatin基因组全长4.3 kb左右,其中启动子区长约1 kb。与cDNA序列的比较显示该基因含有5个外显子和4个内含子,内含子和外显子的交界处严格遵守GT…AG规则。Follistatin基因编码了一个含有323个氨基酸的蛋白质前体,该蛋白质前体含有信号肽区域、N-端结构域、Follistatin结构域Ⅰ、Follistatin结构域Ⅱ、Follistatin结构域Ⅲ和C-端结构域。蛋白比较分析表明Follistatin与其他物种的Follistatin的同源性较高,其结构域保守性更高。三级预测结果显示:在空间构型上,牙鲆Follistatin基因与斑马鱼Follistatin基因完全一致。在序列上高度保守的半胱氨酸在空间上两两相对,它们可能对维持Follistatin蛋白的空间结构起着重要的作用2. RT-PCR方法和原位杂交方法研究Follistatin基因在牙鲆胚胎中的表达情况结果显示:Follistatin基因在受精后26 hrs开始在中胚层细胞处表达,其后在受精后28、30、32、34、36、38、40、42 hrs等时期Follistatin基因持续表达,并在体节腹部部位、头部,背部体节等部位表达。以MyoD为对照而进行的双色原位杂交结果显示:Follistatin与MyoD在胚胎的体节处表达有重叠区域,对双色原位杂交样品进行的冰冻切片实验结果显示:两个基因的表达区域交叉,互相混合,表明Follistatin基因也在肌肉前体细胞中表达,但并不在所有的前体细胞中表达,Follistatin可能在肌肉发育早期起一定的作用。成体组织中,Follitatin基因在体肾、肠、心脏、头肾、脾中有表达,而在肌肉中没有表达。3.启动子序列分析结果表明:牙鲆启动子存在AP-1、C/EBP、SP1、USF、E47、MyoD等转录因子的潜在结合位点。显微注射结果显示:该基因启动子能够使绿

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摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章前言  10-35
  1. 胚胎肌肉的发育  10-11
  2. 鱼类肌肉发育  11-12
  3. 肌肉早期生长发育调控的分子机制  12-21
    3.1 Hedgehogs 因子及其信号通路  14
    3.2 肌肉发育中的Wnt 因子及其信号通路  14-15
    3.3 TGF-β超家族  15-21
  4 Myostatin  21-24
    4.1 Myostatin 基因的结构  21-22
    4.2 Myostatin 的同源性  22
    4.3 Myostatin 的组织特异性  22-23
    4.4 Myostatin 的生物学功能  23-24
  5. Follistatin(FS)基因  24-33
    5.1 Follistatin(FS)及其基因结构特征  24-25
    5.2 Follistatin 的表达情况  25-26
    5.3 Follistatin 的生物学作用及机制  26-32
    5.4 Follistatin 基因表达的调控  32-33
  6. 本研究的意义  33-35
第二章牙鲆 Follistatin 基因的克隆  35-58
  1. 材料与方法  35-38
    1.1 引物  35
    1.2 菌株、培养基、质粒载体、药品、酶和试剂盒  35
    1.3 使用程序  35-36
    1.4 方法  36-38
  2. 结果与讨论  38-53
    2.1 基因组序列的获得  38-40
    2.2 cDNA 序列的获得  40-47
    2.3 序列分析  47-51
    2.4 系统发育树的构建  51-52
    2.5 三级结构预测  52-53
  3. 讨论  53-55
    3.1 基因组组成、cDNA 序列和蛋白质  53-54
    3.2 Follistatin 基因的保守性  54-55
  4. 小结  55-58
第三章 Follistatin 基因的表达研究  58-71
  1. 材料与方法  58-62
    1.1 RT-PCR  58
    1.2 单色原位杂交和双色原位杂交  58-61
    1.3 冰冻切片  61-62
  2. 结果与分析  62-68
    2.1 Follistatin 基因在时间上的表达情况  62
    2.2 Follistatin 在时空上的表达情况  62-64
    2.3 Follistatin 与MyoD 在空间表达情况的比较  64
    2.4 不同组织中Follistatin 的表达情况  64-68
  3. 讨论  68-69
    3.1 Follistatin 基因的多功能性  68
    3.2 Follistatin 基因于眼和脑的发育  68-69
    3.3 Follistatin 基因与肌肉发育  69
  4. 小结  69-71
第四章牙鲆Follistatin 基因启动子分析  71-81
  1. 材料与方法  71-72
    1.1 引物  71
    1.2 使用程序  71
    1.3 Follistatin 的GFP 转基因质粒的构建  71
    1.4 显微注射  71-72
    1.5 结果观察  72
  2. 结果与讨论  72-75
    2.1 启动子序列分析  72-75
    2.2 显微注射结果  75
  3. 讨论  75-78
  4. 小结  78-81
结论  81-82
参考文献  82-95
已发表文章和专利  95-96
致谢  96

Follistatin基因在牙鲆胚胎中的表达及其在肌肉发育中作用的研究

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