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完全甜柿及部分雄性种质间的亲缘关系研究

作　者: 张青林
导　师: 罗正荣
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柿花粉生活力 2n花粉 RAPD ISSR ITS AFLP 起源亲缘关系系统演化
分类号: S665.2
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

中国柿（Diospyros kaki Thunb．）在长期栽培过程中，由于遗传变异和自然、人工选择的作用，分化出了许多宝贵的甜柿资源。本研究对部分柿属雄性种质及甜柿种质采用RAPD、ISSR等分子标记分析，结合对新发现原产中国大别山区雄性种质花粉基础生物学研究，建立和优化柿属植物ITS-PCR及AFLP技术体系，对部分柿属雄性种质间亲缘关系、系统演化及遗传多样性进行了分析比较，探讨柿属雄性种质在中国原产甜柿起源演化中可能的作用。主要结果如下： 1．12份供试雄性种质花粉萌芽率在20.1％—38.5％之间；除台湾正柿及油柿外，其余试材的花粉均能在罗田甜柿的柱头上萌发；雄株2号、雄株3号、雄株8号不含巨大花粉，其余试材有0.18％—4.44％不同比例的巨大花粉存在。 2．对29份柿属雄性种质RAPD分析结果如下：从118条随机引物中筛选得到32条引物，共扩增得到499条谱带，平均多态性比率87.17％，26个种质特异性标记，平均多态性信息含量为0.6097。3种方法（UPGMA法，ME法，Wagner简约法）聚类分析表明：中国柿种质与日本柿种质明显聚为2个类群，甜柿与涩柿不能截然分开；完全雄性资源同罗田甜柿亲缘关系密切；湘西甜柿和日本甜柿关系密切，宝盖甜柿和磨盘柿（罗田）亲缘关系密切；3种聚类方法结果基本聚类分组结果类似，同时也存在极少数差异；主成分分析和主坐标分析支持聚类分析结果。 3．建立了适合柿属植物的ISSR分析技术体系：25μL反应体系中，含1×Buffer，Mg²⁺2.0或2.5mmol／L，dNTPs 0.2mmol／L，引物0.6μmol／L，Taq DNA聚合酶1U，甲酰胺2％，模板DNA 2.4ng／μL；PCR扩增程序：94℃变性3min；94℃ 30s，（Tm+2）℃（根据引物不同设定）45s，72℃ 1.5min，35个循环；72℃延伸7min；2％琼脂糖电泳分离PCR产物。对52份柿属雄性种质ISSR分析结果如下：从58条ISSR引物中筛选得到20条随机引物，共扩增得到274条谱带，平均多态性比率92.33％，30个种质特异性标记，平均多态性信息含量为0.7119。3种方法聚类分析结果表明中国柿种质、日本柿种质可以分成不同的3-5组，甜柿与涩柿虽不能截然分开，但甜、涩柿种质基本可以分为不同的组，仅有2个完全甜柿种质分在涩柿1组中；3个韩国涩柿品种和中国涩柿品种亲缘关系密切，分组结果和地理起源较为一致；完全雄性种质和罗田甜柿亲缘关系密切，宝盖甜柿

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
缩略词表  13-14
第一章课题的提出和前人研究进展  14-34
  1 课题的提出  14-15
  2 前人研究进展  15-32
    2.1 用于系统学及分类学研究的形态标记和细胞学标记  16-18
      2.1.1 形态标记  16-17
      2.1.2 细胞学标记  17-18
    2.2 用于系统学和遗传多样性研究的分子方法  18-27
      2.2.1 蛋白质标记  18-19
      2.2.2 DNA分子标记  19-27
        2.2.2.1 RFLP分析  19-22
        2.2.2.2 RAPD分析  22-23
        2.2.2.3 SSR分析  23-24
        2.2.2.4 ISSR分析  24-25
        2.2.2.5 AFLP分析  25
        2.2.2.6 序列分析  25-27
        2.2.2.7 反转录转座子  27
    2.3 柿属植物系统分类研究进展  27-30
    2.4 植物性别分化及柿属植物开花习性  30-32
      2.4.1 植物的性别及进化途径  30-31
      2.4.2 果树性别分化类型与柿属植物性别分化类型  31-32
  3 研究目的和内容  32-34
    3.1 研究目的  32-33
    3.2 研究内容  33-34
第二章部分柿属植物基本花粉生物学特性研究  34-40
  1 前言  34
  2 材料与方法  34-36
    2.1 实验材料  34-36
    2.2 实验方法  36
      2.2.1 花粉离体萌发率测定  36
      2.2.2 巨大花粉比例测定  36
      2.2.3 花粉活体萌发观察  36
  3 结果与分析  36-39
    3.1 柿属雄性种质花粉离体萌发率测定  36
    3.2 柿属雄性种质花粉活体萌发观察  36-37
    3.3 柿属雄性种质花粉直径大小及巨大花粉比率  37-39
  4 讨论  39-40
    4.1 柿完全雄性资源与遗传育种  39
    4.2 柿完全雄性资源2n花粉潜在育种学价值  39-40
第三章柿属雄性种质亲缘关系的RAPD分析  40-59
  1 前言  40-41
  2 材料与方法  41-47
    2.1 实验材料  41-42
    2.2 实验方法  42-47
      2.2.1 主要试剂及仪器  42-43
      2.2.2 基因组总DNA的提取与质量检测  43-45
      2.2.3 RAPD-PCR分析  45
      2.2.4 数据处理及分析方法  45-47
        2.2.4.1 计算有关遗传参数  45-46
        2.2.4.2 聚类分析  46
        2.2.4.3 主坐标分析  46-47
  3 结果与分析  47-55
    3.1 柿属植物RAPD反应体系优化  47
    3.2 RAPD扩增产物的多态性分析  47-49
    3.3 基于RAPD标记的聚类分析  49-53
      3.3.1 29份柿种质基于UPGMA法的聚类分析  49-51
      3.3.2 29份柿种质基于ME法的聚类分析  51-52
      3.3.3 29份柿种质基于Wagner简约法的聚类分析  52-53
    3.4 RAPD标记的主坐标分析  53-55
  4 讨论  55-59
    4.1 RAPD用于系统学研究的可靠性  55-56
    4.2 RAPD标记同柿属植物研究中分子标记多态性比较  56
    4.3 RAPD聚类结果同柿属植物其它分子系统学研究比较  56-58
    4.4 雄花性状和甜涩性状与系统分类  58-59
第四章柿属雄性种质亲缘关系ISSR分析  59-84
  1 前言  59
  2 材料与方法  59-62
    2.1 实验材料  59
    2.2 实验方法  59-62
      2.2.1 主要试剂及仪器  59-61
      2.2.2 基因组总DNA的提取与质量检测  61
      2.2.3 ISSR-PCR反应体系优化  61-62
  3 结果与分析  62-78
    3.1 ISSR技术体系建立  62-68
      3.1.1 Mg~(2+)浓度对ISSR反应的影响  63
      3.1.2 dNTPs浓度对ISSR反应的影响  63-64
      3.1.3 Taq DNA聚合酶浓度对ISSR反应的影响  64
      3.1.4 引物浓度对ISSR反应的影响  64-65
      3.1.5 退火温度对ISSR反应的影响  65-66
      3.1.6 模板DNA浓度对ISSR反应的影响  66
      3.1.7 扩增循环数对ISSR反应的影响  66-67
      3.1.8 柿属植物ISSR指纹图谱构建  67-68
    3.2 52份柿种质ISSR分析  68-78
      3.2.1 ISSR扩增产物的多态性分析  68-70
      3.2.2 基于ISSR标记的聚类分析  70-76
        3.2.2.1 52份柿种质基于UPGMA法的聚类分析  70-73
        3.2.2.2 52份柿种质基于ME法的聚类分析  73-75
        3.2.2.3 52份柿种质基于Wagner简约法的聚类分析  75-76
      3.2.3 ISSR标记的主坐标分析  76-78
  4 讨论  78-84
    4.1 ISSR-PCR扩增反应需注意的问题  78
    4.2 引物及其退火温度与ISSR反应稳定性  78-79
    4.3 ISSR标记多态性同柿属植物其它分子标记研究比较  79-80
    4.4 雄花性状与柿属植物系统分类  80
    4.5 ISSR聚类分析结果同柿属植物其它分子系统学研究比较  80-82
    4.6 外类群与柿属植物系统分类  82-84
第五章 RAPD数据与ISSR数据整合分析  84-90
  1 前言  84
  2 材料与方法  84-86
    2.1 实验材料  84
    2.2 实验方法  84-86
      2.2.1 主要试剂及仪器  84
      2.2.2 基因组总DNA的提取与质量检测  84
      2.2.3 RAPD分析及ISSR分析  84-86
      2.2.4 数据处理及分析方法  86
      2.2.5 RAPD标记和ISSR标记的比较和整合应用  86
  3 结果与分析  86-88
    3.1 RAPD标记和ISSR标记相关性分析  86
    3.2 综合RAPD标记和ISSR标记对28份柿种质的聚类分析  86-88
    3.3 RAPD标记和ISSR标记比较分析  88
  4 讨论  88-90
    4.1 RAPD标记与ISSR标记多态性水平  88-89
    4.2 RAPD标记与ISSR标记结果相关性  89-90
第六章柿属植物ITS-PCR技术与AFLP技术建立  90-108
  1 前言  90-91
  2 材料与方法  91-94
    2.1 实验材料  91
    2.2 实验方法  91-94
      2.2.1 ITS-PCR反应体系优化  91
      2.2.2 AFLP反应体系优化  91-94
  3 结果与分析  94-105
    3.1 柿属植物ITS序列PCR扩增条件优化  94-100
      3.1.1 退火温度对柿属植物ITS序列PCR扩增的影响  95
      3.1.2 引物组合对柿属植物ITS序列PCR扩增的影响  95-96
      3.1.3 添加剂对柿属植物ITS序列PCR扩增的影响  96-97
      3.1.4 变性温度对老鸦柿ITS序列PCR扩增的影响  97-98
      3.1.5 PCR仪对5份柿属植物ITS序列PCR扩增的影响  98
      3.1.6 柿属植物ITS-PCR技术体系  98-100
    3.2 柿属植物AFLP技术体系建立  100-105
      3.2.1 双酶切对扩增结果的影响  100-101
      3.2.2 连接产物稀释倍数  101
      3.2.3 Mg~(2+)浓度对预扩增和选择性扩增的影响  101-105
  4 讨论  105-108
    4.1 DNA质量、引物及测序手段对柿属植物ITS分析的影响  105-106
    4.2 柿属植物AFLP反应体系建立需要注意的问题  106-108
第七章总讨论  108-114
  1 柿属植物及完全甜柿起源演化途径  108-110
  2 雄性资源在甜柿起源演化途径中的作用  110-111
  3 进一步开展中国甜柿起源演化研究思路  111-112
  4 不同聚类方法对聚类分析结果的影响  112-113
  5 不同分子标记手段对分子系统学研究的影响  113-114
参考文献  114-126
附录  126-128
致谢  128-129
攻读博士期间发表论文  129

完全甜柿及部分雄性种质间的亲缘关系研究

内容摘要

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