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中度嗜盐菌BYS-1（Halomonas sp.）的生物学特性及其耐盐相关基因的克隆

作　者: 洪青
导　师: 李顺鹏；朱军
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苯乙酸中度嗜盐菌甜菜碱醛脱氢酶基因盐敏感突变株耐盐相关基因克隆
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

从处理苯乙酸废水的活性污泥中分离到一株能矿化苯乙酸的中度嗜盐菌BYS-1,经生理生化分析和16S rDNA(GenBank Accession No. AY0662217)序列同源性比较,将它初步鉴定为盐单胞菌属(Halomonas sp)。BYS-1的最适生长pH,温度和NaCl浓度分别为7.2、30℃和1.0M,该菌能利用苯胺、苯酚和水杨酸作为底物生长,但不能利用邻苯二酚和对苯二酚,对苯甲酸的利用能力很弱。BYS-1能耐受多种重金属离子,Zn2+, Cu2+, Ba2+,Mn2+对其降解苯乙酸没有明显的影响,Co2+和Cr3+对其降解稍有影响,Cd2+和Pb2+则抑制其降解。BYS-1在不同NaCl浓度的培养基中生长时,胞内的Na+含量基本不变,主要通过积累K+、谷氨酸、和甜菜碱来调节胞内外的渗透压平衡,当培养基中的NaCl浓度从0.1M上升到2.0M时,其胞内的K+、谷氨酸、和甜菜碱含量分别提高了1.9、2.8和13.6倍,在高盐条件下,主要以积累甜菜碱为主。通过在培养基中添加甜菜碱合成前体(胆碱、甘氨酸)的方法发现BYS-1能以胆碱为前体合成甜菜碱,而且合成量的多少和培养基中的盐浓度呈正相关;根据Genbank已登录的Halomonas elongata的betB序列设计引物,通过PCR的方法克隆了BYS-1的甜菜碱醛脱氢酶的基因(betB)并进行了测序,序列比较结果显示BYS-1的betB序列和Halomonas elongata的betB序列同源性为98%。构建了高效表达载体pET32a-betB,并在大肠杆菌中进行了高效表达.表达产物占菌体总蛋白的31.5%,酶活为38.5 U/mg.protein。通过固体亚硝基诱变法,得到了一株性状稳定的盐敏感突变株BYS-1M,该菌不能在NaCl浓度高于10%的Gibbons培养基上生长;通过前体添加实验表明,BYS-1M的盐敏感性不是由于甜菜碱合成途径受到破坏引起的,可能是某个调控元件发生突变所致。建立了BYS-1的总DNA提取方法,提取了满足构建基因文库要求的高质量的总DNA,以pBBR1MCS-2为载体在E.coli DH5α中构建了高质量的BYS-1总DNA文库,重组质粒pBBR-X中的外源片段插入率在90%以上,外源片段的平均长度为7.5Kb左右。以文库菌E.coli DH5α(pBBR-X)为供体菌、E.coliWD803(pRK2013)为辅助菌、BYS-1M为受体菌进行三亲接合筛选恢复耐盐特性的接合子,得到了恢复耐盐性能的接合子HR-23和HR-96,提取接合子HR-23和HR-96中的重组质粒pHR23和pHR96,酶切确定其插入片段的大小分别为5.4Kb和21Kb,选取pHR23进行亚克隆。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-10
文献综述  10-46
  一、中度嗜盐菌研究概况  10-15
  二、中度嗜盐菌的生理特性  15-29
  三、中度嗜盐菌的渗透调节机制  29-34
  四、中度嗜盐菌遗传学方面的研究  34-41
  五、中度嗜盐菌的应用  41-46
第一章中度嗜盐菌BYS-1 的分离和鉴定  46-57
  1. 材料与方法  46-48
  2. 结果与讨论  48-56
  3. 小结  56-57
第二章中度嗜盐菌BYS-1 耐盐机理的研究  57-67
  1. 材料和方法  57-59
  2. 结果与讨论  59-66
  3. 小结  66-67
第三章中度嗜盐菌BYS-1 甜菜碱醛脱氢酶基因(BETB)的克隆和表达  67-74
  1. 材料和方法  67-68
  2. 结果与讨论  68-73
  3. 小结  73-74
第四章中度嗜盐菌BYS-1 的诱变及盐敏感突变株筛选  74-78
  1. 材料和方法  74-75
  2. 结果与讨论  75-77
  3. 小结  77-78
第五章中度嗜盐菌BYS-1 总DNA 文库的构建  78-88
  1. 材料和方法  78-84
  2. 结果与讨论  84-87
  3. 小结  87-88
第六章中度嗜盐菌BYS-1 耐盐相关基因的克隆  88-106
  1. 材料和方法  88-89
  2. 结果与讨论  89-104
  3. 小结  104-106
全文总结  106-108
参考文献  108-122
附录I 符号及缩略语说明  122-123
附录II 试剂配方  123-125
附件III 发表文章  125-126
致谢  126

中度嗜盐菌BYS-1（Halomonas sp.）的生物学特性及其耐盐相关基因的克隆

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