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广东大肠杆菌耐药性及整合子/基因盒分子流行病学研究

作　者: 吴聪明
导　师: 陈杖榴
学　校: 华南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 大肠杆菌耐药性耐药性监测整合子基因盒
分类号: S852.61
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

开展动物源细菌耐药性调查,了解养殖场抗菌药物选择压力,监测动物源细菌尤其是动物源致病菌耐药性的发生发展动态,跟踪动物源耐药菌的扩散并评估其危险性具有重要的理论及实际意义。目前我国这方面的研究尚待开展。本研究分两部分: (一)采用WHO推荐的纸片扩散法,按NCCLS(1999)判定标准,检测了1524株分离自规模化猪场(522株)、鸡场(220株)、奶牛场(200株)、猪屠场(120株)、各类市售鲜肉(148株)及健康学生志愿者(85株)的大肠杆菌对21种常用抗菌药物的耐药性,分析比较各来源大肠杆菌对各种抗菌药物的耐药率及多重耐药情况,结果如下: 各类养殖场动物大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药率以青霉素类、四环素类、磺胺类抗菌药物最高,以头孢菌素类、丁胺卡那霉素、多粘菌素B抗菌药物最低,对链霉索、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等抗菌药物的耐药性较普遍,各类动物分离菌对FQs耐药率虽有差异,但耐药菌也较普遍;来源于各类动物的大肠杆菌对多种抗菌药物耐药性以猪源及鸡源较严重,牛源较轻,其中对FQs的耐药性,鸡源大肠杆菌约40%,猪源大肠杆菌约25%,牛源仅3.5%,三者之间存在显著差异;不同年龄动物分离大肠杆菌对多数测试药物(尤其是FQs)的耐药性,以幼龄动物分离菌较严重,成年动物分离菌较轻,预防性用药动物群最严重。分离大肠杆菌的耐药性与各养殖场的用药模式即使用抗菌药物种类、数量、频度等高度相关。养殖场内动物、环境及饲养员分离大肠杆菌对21种抗菌药物的耐药率存有差异,但整体耐药趋势分布相似,尤其是动物与环境分离菌的耐药趋势分布更接近;同场动物、环境及饲养员分离大肠杆菌中还有一定比例的同耐药谱多耐药菌株,包括FREC,表明养殖动物、养殖环境及饲养员之间可能存在耐药菌相互传播,或者处于相同的药物选择压力,筛选出相似的耐药菌。分离自饲养员、屠宰人员及健康学生人群的大肠杆菌对21种抗菌药物的耐药性存在差异,除几种敏感药物(头孢菌素类、丁胺卡那霉素、多粘菌素B等)外,对养殖业常用抗菌药物如青霉素类、四环素类、磺胺药等的耐药率以饲养员分离菌最高,屠宰加工人员次之,普通人群最低;三类人群分离菌的多重耐药情况也一样,表明长期从事动物养殖或动物屠宰等工作的人群,体内肠道菌耐药性将因动物耐药菌的扩散而加重。屠宰场候宰猪、屠宰环境分离大肠杆菌与宰后猪胴体分离大肠杆菌对21种抗菌

全文目录

前言  12-16
第一章养殖场、屠宰场及肉食品大肠杆菌耐药性调查研究  16-61
  1 材料与方法  16-21
    1．1 材料  16-18
      1．1．1 样本  16-17
        1．1．1．1 养殖场  16
        1．1．1．2 猪屠宰场  16-17
        1．1．1．3 市售鲜肉及卤烤肉  17
        1．1．1．4 普通健康人群  17
      1．1．2 培养基、细菌生化鉴定管、药敏纸片及其它试剂  17
        1．1．2．1 培养基  17
        1．1．2．2 细菌生化鉴定管  17
        1．1．2．3 药敏纸片  17
      1．1．3 标准菌株  17
      1．1．4 主要仪器与设备  17-18
    1．2 方法  18-21
      1．2．1 样本采集  18
      1．2．2 细菌分离、鉴定与保存  18
        1．2．2．1 大肠杆菌随机分离  18
        1．2．2．2 细菌鉴定  18
        1．2．2．3 细菌保存  18
      1．2．3 FQs耐药大肠杆菌携带率调查  18-19
      1．2．4 FQs耐药大肠杆菌筛选分离  19
      1．2．5 大肠杆菌分离菌株对21种抗菌药物体外敏感性测定  19-21
        1．2．5．1 菌株样本  19
        1．2．5．2 纸片质控  19
        1．2．5．3 细菌药敏试验  19
        1．2．5．4 细菌药敏试验结果判定  19-20
        1．2．5．5 细菌药物敏感性统计及耐药性比较  20-21
  2 结果与分析  21-59
    2．1 标本收集及菌株分离结果  21-23
      2．1．1 养猪场  21
      2．1．2 养鸡场  21
      2．1．3 奶牛场  21-22
      2．1．4 猪屠宰场  22
      2．1．5 市售鲜肉及卤烤肉  22
      2．1．6 健康普通人群  22-23
    2．2 养殖场抗菌药物使用情况  23-24
      2．2．1 养猪场  23
      2．2．2 养鸡场  23-24
      2．2．3 奶牛场  24
    2．3 分离大肠杆菌对21种抗菌药物的体外敏感性  24-33
      2．3．1 养猪场  24-25
      2．3．2 养鸡场  25
      2．3．3 奶牛场  25
      2．3．4 猪屠宰场分离大肠杆菌的敏感试验结果  25-26
      2．3．5 市售鲜肉及肉制品分离大肠杆菌的敏感试验结果  26
      2．3．6 普通健康人群分离大肠杆菌的敏感试验结果  26-33
    2．4 不同来源大肠杆菌对21种抗菌药物耐药性比较分析  33-40
      2．4．1 鸡群、猪群及牛群分离大肠杆菌耐药性比较  33
      2．4．2 幼龄禽／畜与大龄禽／畜分离大肠杆菌耐药性比较  33-35
      2．4．3 用药禽／畜群与未用药禽畜群分离大肠杆菌耐药性比较  35-36
      2．4．4 养殖场动物、饲养员、环境分离大肠杆菌耐药性比较  36-38
      2．4．5 猪宰前、宰后及屠宰加工人员分离大肠杆菌耐药性比较  38
      2．4．6 适龄上市食用动物与市售鲜肉分离大肠杆菌耐药性比较  38-39
      2．4．7 饲养员、屠宰人员及普通人群分离大肠杆菌耐药性比较  39-40
    2．5 不同来源大肠杆菌对9类抗菌药物耐药谱的比较分析  40-52
      2．5．1 猪场Ⅰ  41
      2．5．2 猪场Ⅱ  41
      2．5．3 猪场Ⅲ  41-42
      2．5．4 种鸡场  42
      2．5．5 奶牛场  42-43
      2．5．6 猪屠宰场  43
      2．5．7 鲜肉与熟肉食品  43-44
      2．5．8 三类人群  44-52
    2．6 不同来源大肠杆菌多重耐药分析  52-56
      2．6．1 鸡群、猪群及奶牛群分离大肠杆菌多重耐药比较  52-55
      2．6．2 三类人群分离大肠杆菌多重耐药比较  55-56
    2．7 养殖场FREC携带率调查及FREC与FSEC菌株耐药性比较  56-59
  3 本章小结  59-61
第二章猪场大肠杆菌整合子／耐药基因盒分子流行病学研究  61-91
  1 材料与方法  61-71
    1．1 材料  61-63
      1．1．1 菌株  61
      1．1．2 试剂  61-63
        1．1．2．1 培养基配制  61-62
        1．1．2．2 缓冲液及其它试剂配制  62
        1．1．2．3 酶试剂  62
        1．1．2．4 克降载体  62-63
        1．1．2．5 DNA分子量标准  63
        1．1．2．6 分子生物学试剂盒  63
        1．1．2．7 其它试剂  63
      1．1．3 主要设备及仪器  63
    1．2 方法  63-71
      1．2．1 菌株的收集、分离与鉴定  63
      1．2．2 菌株体外抗菌药物敏感性试验  63-64
      1．2．3 PCR检测Ⅰ型整合子及基因盒  64-67
        1．2．3．1 引物设计及合成  64
        1．2．3．2 PCR模板的制备  64-66
          1．2．3．2．1 细菌总DNA的提取  64-65
          1．2．3．2．2 细菌质粒DNA的提取  65-66
        1．2．3．3 PCR  66-67
          1．2．3．3．1 整合酶基因PCR反应体系及PCR反应条件  66
          1．2．3．3．2 基因盒插入区PCR及降落PCR反应条件  66-67
          1．2．3．3．3 菌落PCR  67
          1．2．3．3．4 菌体总DNA模板PCR  67
          1．2．3．3．5 质粒模板PCR  67
      1．2．4 PCR产物电泳分析及回收  67-69
        1．2．4．1 电泳分析  67-68
        1．2．4．2 基因盒插入区PCR产物的回收  68-69
      1．2．5 基因盒插入区目的片段的连接及转化  69-70
        1．2．5．1 目的片段与克隆载体的连接  69
        1．2．5．2 感受态细胞的制备  69
        1．2．5．3 重组质粒的转化  69-70
        1．2．5．4 目的片段成功克隆的确认  70
          1．2．5．4．1 阳性转化子菌落PCR鉴定  70
          1．2．5．4．2 重组质粒PCR鉴定  70
      1．2．6 基因盒插入区片段的测序  70
      1．2．7 同类大小基因盒插入区片段的酶谱分析  70
      1．2．8 基因盒插入区片段核苷西酸序列与登录基因盒序列及其翻译蛋白氨基酸序列比较  70-71
  2 结果与分析  71-90
    2．1 整合子、耐药基因盒调查方法的选择及Ⅰ型整合子检测结果  71-73
      2．1．1 菌落PCR、降落PCR与常规PCR结果的比较  71-72
      2．1．2 猪场大肠杆菌Ⅰ型整合子检出情况  72-73
    2．2 基因盒插入区PCR扩增结果及猪场大肠杆菌Ⅰ型整合子流行种类  73-81
      2．2．1 猪场分离大肠杆菌Ⅰ型整合子基因盒插入区PCR扩增结果  73
      2．2．2 各种基因盒插入区片段测序及酶切图谱分析  73-75
      2．2．3 猪场分离大肠杆菌各种Ⅰ型整合子的流行情况  75-77
      2．2．4 不同来源大肠杆菌Ⅰ型整合子的流行情况  77-79
      2．2．5 菌株多重耐药、耐药谱与整合子／耐药基因盒的流行病学关系  79-81
    2．3 猪场大肠杆菌流行的各种Ⅰ型整合子整合的耐药基因  81-90
      2．3．1 插入基因盒与genbank数据库中登录的相近基因盒的同源性比较  81-85
      2．3．2 猪场大肠杆菌流行的各类耐药基因盒亲缘关系分析  85-86
      2．3．3 猪场大肠杆菌流行的各种Ⅰ型整合子模式图  86-90
  3 本章小结  90-91
第三章广东地区动物源大肠杆菌耐药性及Ⅰ型整合子／基因盒分子流行病学的讨论  91-99
  3．1 养殖场抗菌药物的使用与动物源细菌耐药性的关系  91-93
  3．2 动物源耐药菌的扩散及向人体的传播  93-94
  3．3 细菌耐药性扩散机制的研究及整合子-基因盒系统  94-95
  3．4 猪场大肠杆菌Ⅰ型整合子及耐药基因盒的流行病学  95-97
  3．5 整合子及基因盒的检测方法  97-99
结论  99-100
致谢  100-101
参考文献  101-107
英文摘要  107-110
附录Ⅰ 文献综述  110-133
附录Ⅱ 各种Ⅰ型整合子插入基因盒与genbank数据库中登录基因盒同源性比较  133-172
附录Ⅲ 各类基因盒插入区扩增片段测序图  172-199
附录Ⅳ 攻读博士学位期间论文发表情况及获奖情况  199

广东大肠杆菌耐药性及整合子/基因盒分子流行病学研究

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