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蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a抗黑色素瘤细胞侵袭转移作用

作　者: 徐剑文
导　师: 林建银；林旭
学　校: 福建医科大学
专　业: 内科学
关键词: 蛇毒金属蛋白酶抑制剂(BJ46a) 基因合成 基因转染 重组蛋白 B16细胞 侵袭转移
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 58次
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内容摘要


BJ46a(46-kDa isoform a from B. jararaca)是来自美洲矛头蝮(Bothrops jararaca)血清的一类金属蛋白酶抑制剂,属cystatin超家族的胎球蛋白(fetuin)家族成员。BJ46a能有效抑制蛇毒金属蛋白酶(snake venom metalloproteinases, SVMPs)蛋白水解活性,作用位点在金属蛋白酶结构域。鉴于SVMPs与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)同属Metzincins(锌依赖金属蛋白酶)家族,因此BJ46a可能通过与MMPs结合,抑制肿瘤的侵袭转移。本研究应用基因工程技术,体外合成BJ46a基因,以杆状病毒表达系统生产重组BJ46a蛋白,并利用基因转染技术和体内外肿瘤侵袭转移实验模型,从蛋白和基因水平探讨BJ46a抗肿瘤侵袭转移作用。一、BJ46a基因合成根据GenBank中查找的BJ46a基因序列(AF294836),将其分为20个片段,通过缓慢退火PCR法使之拼接为完整的BJ46a基因,经SacI及XhoI双酶切后定向克隆到载体pET-42a(+)中,PCR扩增、酶切及测序鉴定;根据测序结果用定点突变法逐一改正错误位点。最终获得的pET-42a(+)/BJ46a质粒,为后续蛋白和基因水平的研究提供了正确的目的基因。二、BJ46a在杆状病毒系统中的表达及其抗黑色素瘤细胞侵袭转移作用在成功合成BJ46a基因的基础上,将其插入到杆状病毒转座载体pFastBac HT C的MCS中,转化大肠杆菌DH5α-T1,以LB/AP平板筛选阳性重组子,PCR扩增、酶切鉴定,提取pFastBac HT C-BJ46a重组体进一步转化DH10Bac感受态细胞,48h后通过蓝白筛选,挑取单个白色菌落划线,证实所得菌落均为白斑,挑克隆PCR鉴定。结果表明成功构建杆状病毒重组转座载体、重组穿梭载体。以Cellfectin脂质体与重组杆状病毒Bacmid-BJ46a混合,转染Sf9昆虫细胞,获P1病毒株;小规模、低滴度P1病毒株再感染昆虫细胞获得更高滴度的P2病毒株,进而扩增P3病毒株;将较高滴度的重组杆状病毒液感染Sf9,Western blot示重组BJ46a蛋白能有效表达,且最佳表达时间为感染后4d。经ProBond亲和层析纯化出的重组BJ46a蛋白具有抑制MMPs的活性。利用Transwell小室分析重组BJ46a蛋白对小鼠B16细胞体外侵袭能力的影响,结果表明:重组BJ46a蛋白处理的B16细胞穿过Matrigel的细胞数明显低于对照组(P<0.01),抑制率为84.8%。重组BJ46a蛋白处理的B16细胞经尾静脉接种C57BL/6小鼠,建立B16细胞实验性肺转移模型,20d后处死小鼠示其肺部转移瘤灶较对照组明显减少(P<0.001)。这些证明重组BJ46a蛋白能抑制小鼠黑色素瘤细胞的侵袭转移。三、BJ46a稳定转染及其抗黑色素瘤细胞侵袭转移作用构建BJ46a真核表达载体pcDNA3.1HisC-BJ46a,fugene 6法转染B16细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,RT-PCR鉴定,alamarblue法检测BJ46a稳定转染细胞克隆株体外生长和粘附能力的变化,Transwell小室和小鼠实验性肺转移模型分析BJ46对黑色素瘤细胞体内、外侵袭力的影响。结果示B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a稳定转染细胞株体外侵袭能力明显降低,其穿膜的细胞数显著低于B16/pcDNA3.1 HisC空载体组和空白对照B16细胞组(P<0.01),抑制率为59.2%;其体外增殖、粘附、运动能力未见明显改变。BJ46a的稳定转染可抑制C57BL/6小鼠肺转移瘤灶的形成(P<0.05)。以上结果证明BJ46a从基因水平抑制B16细胞的体内外侵袭转移。本研究结果首次证明了BJ46a具有抑制B16细胞侵袭转移功能,为其作为抗肿瘤侵袭转移药物的进一步研制和开发应用提供理论依据和前提条件。

全文目录


英文缩略语  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
第一部分：BJ46a 基因的合成  14-41
  材料与方法  14-29
  结果  29-39
  讨论  39-40
  小结  40-41
第二部分：BJ46a 在杆状病毒系统中的表达及其抗黑色素瘤细胞侵袭转移作用  41-85
  材料与方法  42-58
  结果  58-81
  讨论  81-84
  小结  84-85
第三部分：BJ46a 稳定转染及其抗黑色素瘤细胞侵袭转移作用  85-115
  材料与方法  85-95
  结果  95-111
  讨论  111-114
  小结  114-115
结论  115-116
参考文献  116-131
在学期间从事的科研工作  131-132
致谢  132

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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