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微流控芯片上单细胞分析的研究

作　者: 孙悦
导　师: 殷学锋
学　校: 浙江大学
专　业: 分析化学
关键词: 单细胞分析微芯片电泳激光诱导荧光多深宽芯片脂质体细胞内衍生荧光染料 ROS GSH
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

检测单个细胞内化学组分,以及测定单细胞对外界刺激的成分变化,有助于理解基本细胞功能以及细胞内外联系,有助于检测和鉴别大量细胞群体中少量的不正常细胞,因此单细胞的研究在重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究方面有重要意义,已成为目前生命科学、生化分析等学科研究的热门课题之一。由于单细胞体积小,胞内物质浓度低,需要高灵敏度的检测方法,如激光诱导荧光（LIF）法。但是大多数胞内组分浓度低又无天然荧光,因此在解决微衍生的问题上还存有相当的空间。最近,用微流控芯片技术对生物细胞的研究引起了广泛注意,在近些年来得到快速发展。微流控芯片微米尺寸的通道适于单细胞引入,操纵,反应,分离及检测。本论文首次用芯片毛细管电泳—激光诱导荧光法定量测定了单个人血红细胞内的活性氧（ROS）,将细胞进样、单细胞定位、溶膜和毛细管电泳分离,集成到一块玻璃微芯片完成。ROS包括超氧阴离子(O₂^·-)、羟自由基（·OH）、过氧化氢等,它不但与衰老、动脉硬化、关节炎、细胞凋亡及癌变等密切相关,并且由于它易扩散和降解,普遍存在于各类细胞中,它还起细胞间信使分子的作用。因此,细胞内ROS的测定已受到普遍重视。我们用可透膜的双氢罗丹明123（DHR 123）作为衍生试剂,DHR 123无荧光,进入细胞后,以细胞本身作为微反应器,和细胞内ROS反应生成荧光产物罗丹明123（Rh 123）,通过微芯片电泳激光诱导荧光法检测细胞内的Rh123,间接对细胞内ROS进行了定量。我们讨论了Rh123迁移时间随pH的变化,得到最佳检测条件,通过标准曲线法,定量测定了单个人血红细胞内ROS。该法由于避免了制备细胞悬液时溶剂的稀释作用,使分析灵敏度大大提高。方法检测下限为0.74amol,每分钟检测两个细胞,连续测定6个单细胞迁移时间的精密度为2.1%。为研究单细胞受外界刺激前后ROS的变化提供了方法和工具。在微流控芯片单细胞分析中,细胞能够进入微通道是微流控芯片分析细胞的

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章文献综述  13-59
  §1.1 引言  13-15
  §1.2 芯片和毛细管电泳单细胞组分测定  15-33
    §1.2.1 细胞进样  15-22
      §1.2.1.1 单细胞溶解进样  15-16
      §1.2.1.2 细胞质进样  16-17
      §1.2.1.3 单个全细胞进样  17-22
    §1.2.2 细胞定位  22-24
    §1.2.3 细胞溶膜  24-28
    §1.2.4 细胞衍生  28-32
      §1.2.4.1 柱前衍生  28-30
      §1.2.4.2 柱上衍生  30-32
      §1.2.4.3 柱后衍生  32
    §1.2.5 检测技术  32-33
  §1.3 脂质体研究  33-47
    §1.3.1 脂质体制备  35-40
    §1.3.2 脂质体和细胞作用  40-42
    §1.3.3 脂质体在化学领域的应用  42-47
  §1.4 参考文献  47-59
第二章微流控芯片上单个人血红细胞内ROS的测定  59-68
  §2.1 引言  59
  §2.2 实验部分  59-61
    §2.2.1 仪器  59-60
    §2.2.2 试剂  60
    §2.2.3 细胞样品处理  60-61
    §2.2.4 分析步骤  61
      §2.2.4.1 标准溶液测定  61
      §2.2.4.2 单细胞中ROS的测定  61
  §2.3 结果与讨论  61-66
    §2.3.1 细胞样品处理  61-62
    §2.3.2 电泳缓冲溶液  62-64
    §2.3.3 定量方法  64-65
    §2.3.4 单细胞中ROS的测定  65-66
  §2.4 结论  66
  §2.5 参考文献  66-68
第三章用于单个肿瘤细胞分析的新型多深度微流控芯片  68-78
  §3.1 引言  68-69
  §3.2 实验部分  69-71
    §3.2.1 仪器装置  69
    §3.2.2 多深度微流控芯片的制作  69-70
    §3.2.3 试剂  70-71
    §3.2.4 细胞内ROS和GSH的标记  71
    §3.2.5 用多深度微流控芯片检测单细胞  71
  §3.3 结果与讨论  71-75
    §3.3.1 芯片的设计与制作  71-73
    §3.3.2 细胞的进样和溶膜  73-74
    §3.3.3 用多深度微流控芯片分析肝癌细胞内的ROS和GSH  74-75
  §3.4 结论  75
  §3.5 参考文献  75-78
第四章纳米脂质体包裹荧光试剂进入单细胞的研究  78-95
  §4.1 引言  78-79
  §4.2 实验部分  79-82
    §4.2.1 试剂  79
    §4.2.2 仪器  79-80
    §4.2.3 脂质体制备  80
    §4.2.4 细胞培养  80
    §4.2.5 脂质体进入细胞的条件测定  80-81
    §4.2.6 脂质体作用细胞后细胞活性的测定  81
    §4.2.7 标准溶液的芯片电泳  81
    §4.2.8 细胞样品处理  81-82
    §4.2.9 单细胞微流控芯片检测  82
  §4.3 结果与讨论  82-92
    §4.3.1 脂质体的制备和性质  82-84
      §4.3.1.1 脂质体制备的影响因素  82-83
      §4.3.1.2 脂质体的稳定性  83
      §4.3.1.3 脂质体的包封率和密度  83-84
    §4.3.2 脂质体介导荧光试剂进入细胞  84-86
    §4.3.3 脂质体介导荧光试剂进入细胞的影响因素  86-89
      §4.3.3.1 培养时间的影响  86-87
      §4.3.3.2 脂质体浓度的影响  87-88
      §4.3.3.3 FITC浓度的影响  88
      §4.3.3.4 Ca~(2+)的影响  88-89
    §4.3.4 脂质体对细胞活性的影响  89
    §4.3.5 芯片毛细管电泳激光诱导荧光检测FITC进入细胞后的衍生效果  89-92
  §4.4 结论  92
  §4.5 参考文献  92-95
第五章 SOD脂质体清除肝癌细胞内活性氧能力在微流控芯片上的测定  95-106
  §5.1 引言  95-96
  §5.2 实验部分  96-98
    §5.2.1 仪器装置  96-97
    §5.2.2 试剂  97
    §5.2.3 SOD的FITC染色  97
    §5.2.4 脂质体制备  97
    §5.2.5 脂质体投递SOD进入细胞  97
    §5.2.6 细胞内ROS和GSH衍生  97-98
    §5.2.7 微流控芯片检测单细胞  98
  §5.3 结果与讨论  98-103
    §5.3.1 共聚焦荧光显微镜验证脂质体介导SOD-FITC进入细胞  98-99
    §5.3.2 用芯片毛细管电泳测定脂质体密度对SOD—FITC进入细胞量的影响  99-100
    §5.3.3 用芯片毛细管电泳测定HepG2肝癌细胞内活性氧  100-101
    §5.3.4 用芯片毛细管电泳测定脂质体介导SOD清除细胞内活性氧能力  101
    §5.3.5 流式细胞仪方法测定脂质体介导SOD清除细胞内自由基能力  101-103
  §5.4 结论  103
  §5.5 参考文献  103-106
附录  106-107
致谢  107-108
独创性声明  108
学位论文版权使用授权书  108

微流控芯片上单细胞分析的研究

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