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双生病毒卫星DNA的βC1基因缺失突变体的致病性及稳定性测定和缺失突变体的利用

作　者: 钱亚娟
导　师: 周雪平
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 双生病毒 中国番茄黄化曲叶病毒 烟草曲茎病毒 DNAβ βCl缺失突变体 致病性 稳定性 表达载体 病毒诱导的基因沉默
分类号: S432.41
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


双生病毒是一类世界范围内广泛发生的具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒,近年来已在多种作物上造成毁灭性危害,给作物生产造成了严重损失。卫星DNAβ是与一些单组份双生病毒伴随的并是病毒在自然寄主上引起典型症状所必需的致病相关分子。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链都含有一个位置和大小保守的βC1基因。为了弄清双生病毒DNAβ分子参与致病的机理,本论文对缺失βC1基因的DNAβ分子的致病性及稳定性进行了研究,并利用缺失βC1基因的DNAβ分子进行了外源基因的表达及基因沉默研究。 对中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)DNAβ上的βC1基因进行了功能鉴定。构建了一个βC1基因完全缺失的突变体Y10 DNA△C1β,侵染性测定表明在和TYLCCNV-Y10共同侵染寄主植物时,突变体Y10 DNA△C1β能系统侵染本氏烟、心叶烟、矮牵牛,但不能侵染普通烟、三生烟、番茄,突变体DNA△C1β在寄主上不诱导明显症状。而野生型Y10 DNAβ和TYLCCNV-Y10共同侵染后能够系统侵染以上的所有寄主并且诱导严重的病害症状,侵染效率也高于Y10 DNA△C1β。推测βC1基因是一个参与症状诱导的关键因子并且可能和TYLCCNV-Y10/DNAβ复合体的侵染效率有关。Southern印迹分析显示βC1基因不是TYLCCNV和Y10β复制所必需的,但是它的存在可以增加病毒及卫星在植物组织中的积累量。免疫捕获PCR检测表明,βC1基因缺失的Y10 DNA△C1β(1.0kb)能够包裹在Y10编码的外壳蛋白中。PCR和Southern印迹检测都表明βC1基因缺失的突变体Y10 DNA△C1β在寄主植物中非常稳定,并且能利用多种异源双生病毒复制。 对烟草曲茎病毒Y35分离物(TbCSV-Y35)DNAβ上的βC1基因也进行了功能鉴定。构建了一个βC1基因完全缺失的突变体Y35 DNA△C1β。侵染性测定表明在和TbCSV-Y35共同侵染寄主植物时,突变体Y35 DNA△C1β能够系统侵染本氏烟、心叶烟、矮牵牛、三生烟、普通烟和番茄等寄主,但是与野生型DNAβ相比,TbCSV/DNA△C1β复合体引起的症状减轻,并且缺失βC1基因后TbCSV/DNAβ复合体的侵染效率会有不同程度的下降。Southern印迹分析显示βC1基因缺失对TbCSV-Y35的复制没有明显影响,但是它的缺失使DNAβ在植物组织中的积累水平明显降低。在Y35与Y35 DNA△C1β共同侵染的本氏烟、心叶烟、三生烟、矮牵牛中发

全文目录


致谢  4-9
缩略语表  9-12
摘要  12-14
Abstract  14-16
第一篇 文献综述  16-43
  第一章 双生病毒的致病机制研究进展  16-29
    1 双生病毒的分类及其基因组结构  16-19
      1．1 Mastrevirus属  17
      1．2 Curtovirus属  17
      1．3 Topocuvirus属  17
      1．4 Begomovirus属  17-19
    2 双生病毒与小分子DNA形成病害复合体  19-21
      2．1 类似Nanovirus属病毒的DNA1与双生病毒相伴随  19
      2．2 DNAβ与双生病毒相伴随  19-20
      2．3 双生病毒与小分子DNA形成病毒复合体  20-21
    3 双生病毒的系统侵染过程  21-26
      3．1 双生病毒的复制  21-22
        3．1．1 激活寄主细胞周期  21-22
        3．1．2 合成ssDNA  22
      3．2 双生病毒的转录  22-23
      3．3 双生病毒的移动  23-25
        3．3．1 双组分双生病毒的移动  23
        3．3．2 单组分双生病毒的移动  23-25
      3．4 包壳和传毒  25-26
    4 双生病毒的致病因子及其可能的作用途径  26-29
      4．1 调控细胞周期与病毒致病性的关系  26
      4．2 干扰细胞运动与病毒致病性的关系  26-27
      4．3 抑制基因沉默与病毒致病性的关系  27-29
  第二章 植物病毒作为载体系统的应用进展  29-43
    1 植物病毒作为外源基因表达载体系统的应用  29-36
      1．1 植物病毒表达载体的建立  29-30
      1．2 植物病毒表达载体的优点  30
      1．3 植物病毒表达载体的构建策略  30-33
        1．3．1 基因置换  30-31
        1．3．2 基因插入  31-32
        1．3．3 融合抗原  32-33
        1．3．4 基因互补  33
        1．3．5 融合／释放  33
      1．4 双生病毒作为表达载体的发展及其应用  33-35
      1．5 面临的问题及展望  35-36
    2 植物病毒诱导的基因沉默及在植物基因功能研究中的应用  36-43
      2．1 VIGS体系的建立和发展  36-39
        2．1．1 RNA病毒诱导的VIGS  36-37
        2．1．2 DNA病毒诱导的VIGS  37-38
        2．1．3 RNA卫星诱导的VIGS  38
        2．1．4 DNA卫星诱导的VIGS  38-39
      2．2 VIGS的机制  39-40
      2．3 VIGS中靶基因片段的选取  40-41
      2．4 利用VIGS体系研究植物基因功能的优劣  41-42
        2．4．1 VIGS的优势  41
        2．4．2 VIGS的不足  41-42
      2．5 展望  42-43
第二篇 研究内容  43-103
  第一章 材料与方法  43-53
    1 材料  43
      1．1 植物材料  43
      1．2 菌株和质粒  43
      1．3 试剂与仪器  43
      1．4 常用缓冲液的配制  43
    2 方法  43-53
      2．1 PCR技术  43-45
        2．1．1 普通PCR反应  44
        2．1．2 免疫捕获PCR反应  44
        2．1．3 RT-PCR反应  44-45
      2．2 PCR产物纯化  45
      2．3 DNA克隆技术  45-46
        2．3．1 载体的去磷酸化  45
        2．3．2 连接  45-46
        2．3．3 感受态细胞制备  46
        2．3．4 转化  46
      2．4 重组质粒的提取与鉴定  46-48
        2．4．1 碱裂解法  46-47
        2．4．2 质粒微量提取试剂盒  47-48
        2．4．3 PCR鉴定  48
        2．4．4 酶切鉴定  48
      2．5 植物总DNA提取和Southern印迹分析  48-50
        2．5．1 总DNA提取(CTAB法)  48
        2．5．2 电泳及转膜  48-49
        2．5．3 探针标记  49-50
        2．5．4 预杂交和杂交  50
      2．6 植物总RNA提取  50-51
        2．6．1 器皿和容器的处理  50
        2．6．2 植物总RNA的提取  50-51
      2．7 SDS-PAGE与Western印迹分析  51-53
        2．7．1 植物可溶性蛋白样品的制备  51
        2．7．2 SDS-PAGE  51
        2．7．3 电转移  51-52
        2．7．4 Western印迹分析  52-53
  第二章 中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNAβ的βC1基因缺失突变体的致病性及其稳定性  53-69
    1 材料与方法  53-57
      1．1 毒源  53-54
      1．2 侵染性克隆  54
      1．3 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β的侵染性克隆构建  54-56
      1．4 根癌土壤杆菌接种  56-57
      1．5 PCR和Southern印迹分析  57
      1．6 免疫捕获PCR  57
      1．7 序列测定和分析  57
    2 结果与分析  57-67
      2．1 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β的侵染性克隆构建  57-58
      2．2 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β的侵染性测定  58-60
      2．3 Y10 DNAΔC1β对TYLCCNV-Y10复制的影响  60-61
      2．4 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β复制的稳定性  61-62
      2．5 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β的包壳  62-63
      2．6 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β与其它异源双生病毒的作用  63-67
        2．6．1 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β与其它辅助双生病毒的侵染性测定  63-64
        2．6．2 TYLCCNV-Y10 DNAΔC1β与其它辅助双生病毒作用时的稳定性测定  64-67
    3 讨论  67-69
  第三章 烟草曲茎病毒卫星DNAβ的βC1基因缺失突变体的致病性及其稳定性  69-82
    1 材料与方法  69-72
      1．1 毒源  69
      1．2 TbCSV-Y35 DNAΔC1β侵染性克隆构建  69-71
      1．3 根癌土壤杆菌接种  71
      1．4 PCR和Southern印迹分析  71-72
      1．5 免疫捕获PCR  72
    2 结果与分析  72-80
      2．1 TbCSV-Y35 DNAΔC1β侵染性克隆构建  72-73
      2．2 TbCSV-Y35 DNAΔC1β侵染性克隆的侵染性测定  73
      2．3 Y35 DNAΔC1β对TbCSV复制的影响  73-74
      2．4 TbCSV-Y35 DNAΔC1β复制的稳定性  74-78
      2．5 TbCSV-Y35 DNAΔC1β的包壳  78
      2．6 TbCSV-Y35 DNAΔC1β与异源双生病毒的作用  78-80
    3 讨论  80-82
  第四章 利用中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNAβ的βC1基因缺失突变体进行外源基因表达  82-92
    1 材料与方法  82-84
      1．1 侵染性克隆  82
      1．2 抗血清  82
      1．3 基因表达载体的构建  82-83
      1．4 叶盘法检测病毒基因组的瞬时复制  83-84
      1．5 PCR和Southern印迹分析  84
      1．6 RT-PCR  84
      1．7 Western印迹分析  84
    2 结果与分析  84-90
      2．1 TMV CP基因的表达  84-89
        2．1．1 TMV CP基因的复制  85-86
        2．1．2 TMV CP基因的转录  86
        2．1．3 TMV CP基因的表达  86-87
        2．1．4 TMV CP基因片段插入DNAΔC1β载体的稳定性  87-89
      2．2 GUS基因的表达  89-90
    3 讨论  90-92
  第五章 烟草曲茎病毒的卫星DNA沉默载体构建及其利用  92-103
    1 材料与方法  92-95
      1．1 转GFP本氏烟  92
      1．2 基因沉默载体的构建  92-93
      1．3 根癌土壤杆菌接种  93-94
      1．4 DNA提取及Southern blot杂交  94
      1．5 半定量RT-PCR  94
      1．6 GFP荧光检测与成像  94-95
    2 结果  95-99
      2．1 用DNAΔC1β载体沉默GFP基因  95
      2．2 用DNAΔC1β载体沉默Su基因  95
      2．3 DNAΔC1β载体沉默基因后对基因内源mRNA积累量的影响  95-98
      2．4 DNAΔC1β载体沉默基因后对病毒积累量的影响  98-99
      2．5 DNAΔC1β载体与多种异源双生病毒诱导基因沉默  99
        2．5．1 中国番茄黄化曲叶病毒  99
        2．5．2 赛葵黄脉病毒  99
    3 讨论  99-103
全文小结  103-104
参考文献  104-117
附录A：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  117-118
附录B：常用缓冲液及培养基配方  118-122

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害 > 病毒
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