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棉花GA 20-氧化酶基因的克隆和功能分析

作　者: 肖月华
导　师: 裴炎
学　校: 西南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花 纤维 赤霉素 GA 20-氧化酶 基因工程
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 423次
引　用: 3次
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内容摘要


棉花是世界上最重要的天然纤维作物,我国是重要的产棉大国和纺织品出口国,棉花在我国国民经济中占有重要的地位。作为工业原料作物,一个优良的棉花品种,不仅要产量高,而且纤维品质要好,方能实现其最终产品价值。因此,纤维的产量和品质一直是棉花育种的主要目标。基因工程技术为棉花育种提供了新的策略和广阔前景,但是目前尚未克隆与棉花纤维产量和品质直接相关的基因,纤维产量和品质的基因工程改良还缺乏有效的途径和目的基因。 赤霉素(Gibberellins,GA)是一类重要的植物激素,参与控制种子萌发、茎的伸长、叶片伸展、表皮毛发育、根的生长,以及花和果实的发育等多种多样的发育和生理过程。前人研究表明,GA在棉花纤维发育中有着重要的作用,与纤维产量和品质有着密切的关系。从分子生物学水平阐明GA及其合成酶基因与纤维发育和纤维品质的关系,可能为棉花纤维产量和品质的基因工程改良提供新的策略,具有非常重要的理论和实践意义。 为阐明赤霉素影响棉花纤维发育和品质的分子机理,本论文从棉花纤维中克隆了两个GA 20-氧化酶的同源基因(GhGA20oxl和GhGA20ox2),并进行了基因结构和表达分析。进一步将克隆的GA 20-氧化酶基因在烟草中超量表达,研究了克隆基因的生物功能。最后将GhGA20oxl基因的超量表达和反义抑制载体转化棉花,研究了GhGA20oxl基因的超量表达和反义抑制以及GA合成对在棉花生长发育的影响。另外,论文还克隆了两个棉花GA 20-氧化酶基因的5’-调控序列,并分析了其表达特性。 主要结果如下: 1.棉花GA 20-氧化酶基因的克隆 用拟南芥GA 20-氧化酶基因作探针序列,从棉花纤维EST库中筛选了一个同源序列。根据EST序列设计引物,扩增了相应的基因组序列,并用YADE(Y-shapedAdaptor Dependent Extension)方法扩增了该EST序列的5’-上游序列。序列分析表明,扩增的5’-上游序列包含了相应基因的翻译起始ATG。 根据起始ATG的上游序列设计引物,利用RACE方法从棉花纤维中扩增了两个GA 20-氧化酶的cDNA基因(GhGA20oxl和GhGA20ox2),进一步用YADE法延伸获得了两个基因的启动子和基因组序列。通过序列比较、同源性分析、分子杂交和RT-PCR等方法分析了两个GA 20-氧化酶基因的序列特征、表达特性等。 GhGA20oxl基因cDNA长1401bp,包含的最长ORF为1158bp,编码一个

全文目录


中文摘要  10-14
Abstract  14-19
第一章 文献综述  19-45
  1.1 棉花纤维发育的分子生物学研究进展  19-32
    1.1.1 棉花概述  19-20
      1.1.1.1 棉花的植物学分类  19
      1.1.1.2 棉花纤维的发育过程  19-20
      1.1.1.3 棉花纤维及其分子生物学研究的意义  20
    1.1.2 纤维发育相关基因的克隆和功能分析  20-25
      1.1.2.1 棉花纤维的基因表达分析  21-22
      1.1.2.2 棉花纤维特异或优势表达基因的克隆  22-24
      1.1.2.3 棉花纤维特异或优势表达基因的功能研究  24-25
    1.1.3 棉花纤维发育的分子生理学研究  25-32
      1.1.3.1 MYB基因与棉花纤维的分化起始  25-27
      1.1.3.2 棉花纤维伸长的分子机理  27-29
      1.1.3.3 棉花纤维次生壁合成的启动  29
      1.1.3.4 棉花纤维的纤维素合成  29-32
  1.2 植物激素在棉花纤维发育中的作用  32-45
    1.2.1 赤霉素的分子生物学研究进展  33-44
      1.2.1.1 植物赤霉素的代谢  34-39
      1.2.1.2 赤霉素的信号传导  39-44
    1.2.2 生长素生物合成酶基因与棉花纤维发育  44-45
第二章 引言  45-48
  2.1 论文的立论依据  45-47
  2.2 论文的技术路线  47-48
第三章 棉花GA 20-氧化酶基因的克隆及特征分析  48-83
  3.1 材料  48-50
    3.1.1 植物材料  48
    3.1.2 菌株和载体  48
    3.1.3 主要试剂  48-49
    3.1.4 主要仪器设备  49
    3.1.5 主要试剂和缓冲液配方  49-50
  3.2 方法  50-56
    3.2.1 RNA的提取  50-51
    3.2.2 DNA的提取  51
    3.2.3 EST序列的筛选和扩增  51
    3.2.4 相邻序列的YADE扩增  51-53
    3.2.5 cDNA序列的3′-RACE扩增  53-54
    3.2.6 基因组序列的扩增  54
    3.2.7 扩增产物的回收、克隆和序列测定  54
    3.2.8 序列分析  54-55
    3.2.9 RT-PCR分析  55
    3.2.10 Northern分析  55-56
    3.2.11 Southern分析  56
  3.3 结果与分析  56-79
    3.3.1 EST序列的筛选和扩增  56-57
    3.3.2 g20EST相邻上游序列的YADE扩增  57-60
    3.3.3 棉花GA 20-氧化酶cDNA基因的RACE扩增  60-62
    3.3.4 GhGA20ox2基因的基因组序列的扩增  62-63
    3.3.5 GhGA20ox1基因的基因组序列的扩增  63-70
      3.3.5.1 GhGA20ox1基因5′-上游序列的YADE扩增  63-66
      3.3.5.2 GhGA20ox1基因3′-下游序列的YADE扩增  66-70
    3.3.6 GhGA20ox1和GhGA20ox2的基因组序列的克隆  70
    3.3.7 棉花GA 20-氧化酶的氨基酸序列分析  70-71
    3.3.8 棉花GA 20-氧化酶的同源性分析  71-75
      3.3.8.1 棉花GA 20-氧化酶的同源蛋白查询  71-73
      3.3.8.2 棉花GA 20-氧化酶及其同源蛋白的进化树分析  73
      3.3.8.3 棉花GA 20-氧化酶及其同源蛋白的序列多重比较  73-75
    3.3.9 棉花GA 20-氧化酶基因的基因组结构分析  75-76
    3.3.10 棉花GA 20-氧化酶基因的表达分析  76-79
  3.4 讨论  79-81
    3.4.1 YADE方法的原理与应用  79-80
    3.4.2 基因表达分析的方法  80-81
    3.4.3 棉花GA 20-氧化酶基因家族  81
  3.5 小结  81-83
第四章 棉花GA 20-氧化基因的启动子克隆及表达特性分析  83-100
  4.1 材料  83-85
    4.1.1 植物材料  83
    4.1.2 菌株和载体  83
    4.1.3 主要试剂  83
    4.1.4 主要缓冲液和培养基配方  83-85
  4.2 方法  85-88
    4.2.1 棉花GA 20-氧化酶基因的启动子克隆和序列分析  85
    4.2.2 启动子表达载体构建  85
    4.2.3 根癌农杆菌菌株LBA4404感受态的制备及DNA转化  85-86
    4.2.4 质粒DNA的提取  86
    4.2.5 烟草遗传转化  86-87
    4.2.6 棉花遗传转化  87
    4.2.7 转化烟草的PCR鉴定  87-88
    4.2.8 转化植株的GUS表达特性分析  88
  4.3 结果与分析  88-98
    4.3.1 GhGA20ox1基因的启动子克隆  88-89
    4.3.2 GhGA20ox2基因的启动子克隆  89-91
    4.3.3 pGhGA20ox1和pGhGA20ox2的启动子序列分析  91-92
    4.3.4 启动子表达特性分析载体构建  92-95
      4.3.4.1 pGhGA20ox1的表达特性分析载体的构建  92
      4.3.4.2 pGhGA20ox2的表达特性分析载体的构建  92-95
    4.3.5 pGhGA20ox2在植物中的表达特性分析  95-98
      4.3.5.1 pGhGA20ox2在烟草中的表达特性  95-97
      4.3.5.2 pGhGA20ox2在棉花中的表达特性  97-98
  4.4 讨论  98-99
  4.5 小结  99-100
第五章 棉花GA 20-氧化酶基因在烟草中的超量表达  100-114
  5.1 材料  100-101
    5.1.1 植物材料  100
    5.1.2 菌株和载体  100
    5.1.3 主要试剂  100
    5.1.4 主要缓冲液和培养基配方  100-101
    5.1.5 主要仪器设备  101
  5.2 方法  101-103
    5.2.1 超量表达载体的构建  101
    5.2.2 烟草遗传转化及转化植株的鉴定  101
    5.2.3 转基因表达分析  101-102
    5.2.4 转基因烟草的性状变异分析  102
    5.2.5 赤霉素含量的ELISA测定  102-103
      5.2.5.1 激素的提取  102
      5.2.5.2 样品测定  102-103
      5.2.5.3 结果计算与分析  103
  5.3 结果与分析  103-112
    5.3.1 载体构建  103-105
      5.3.1.1 GhGA20ox1超量表达载体的构建  103-105
      5.3.1.2 GhGA20ox2超量表达载体的构建  105
    5.3.2 GhGA20ox1基因在本明烟中的超量表达  105-110
      5.3.2.1 本明烟的遗传转化  105-107
      5.3.2.2 超量表达GhGA20ox1基因的本明烟的性状变化  107-109
      5.3.2.3 超量表达GhGA20ox1基因对本明烟GA合成的影响  109-110
    5.3.3 GhGA20ox1和GhGA20ox2在普通烟草中的超量表达  110-112
  5.4 讨论  112-113
  5.5 小结  113-114
第六章 GhGA20ox1基因的棉花转基因功能分析  114-134
  6.1 材料  114-115
    6.1.1 植物材料  114
    6.1.2 菌株和载体  114
    6.1.3 主要试剂  114
    6.1.4 主要缓冲液配方  114-115
    6.1.5 主要仪器设备  115
  6.2 方法  115-117
    6.2.1 反义抑制载体的构建  115
    6.2.2 棉花遗传转化  115
    6.2.3 表达分析  115-116
    6.2.4 性状分析  116
    6.2.5 显微观察  116-117
      6.2.5.1 材料的固定、脱水和包埋  116-117
      6.2.5.2 切片、染色和观察  117
    6.2.6 扫描电镜观察  117
  6.3 结果与分析  117-130
    6.3.1 反义抑制载体构建  117-118
    6.3.2 棉花遗传转化  118-120
      6.3.2.1 转基因棉花的获得  118-119
      6.3.2.2 GA 20-氧化酶基因在转基因棉花叶片中的表达  119-120
    6.3.3 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花生长的影响  120-122
    6.3.4 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花花发育的影响  122-125
      6.3.4.1 转基因棉花的花形态和花发育时间变化  122-125
      6.3.4.2 转基因棉花的花药发育进程  125
    6.3.5 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花果实和种子发育的影响  125-126
    6.3.6 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花纤维的影响  126-130
      6.3.6.1 转基因棉花纤维性状的变化  126-128
      6.3.6.2 转基因棉花的纤维起始和早期伸长  128-130
  6.4 讨论  130-133
    6.4.1 GhGA20ox1的超量表达和反义抑制对棉花GA合成的影响  130-131
    6.4.2 GA在棉花发育中的作用  131-133
      6.4.2.1 GA对棉花开花结铃的影响  131-132
      6.4.2.2 GA对棉花花粉发育的影响  132
      6.4.2.3 GA对棉花纤维发育的影响  132-133
  6.5 小结  133-134
第七章 结论  134-136
  7.1 主要结论  134-135
    7.1.1 棉花GA20-氧化酶基因GhGA20ox1的克隆和功能分析  134
    7.1.2 棉花GA20-氧化酶同源基因GhGA20ox2的克隆和功能分析  134
    7.1.3 GA对棉花发育的影响  134-135
    7.1.4 启动子的克隆和功能分析  135
  7.2 论文的创新  135-136
    7.2.1 基因和启动子克隆  135
    7.2.2 棉花GA的内源调控  135-136
参考文献  136-153
致谢  153-154
附录1 缩略词表  154-155
附录2 学习期间在GenBank上登录的基因序列  155-156
附录3 学习期间主持、参加的主要项目和发表的文章  156-158
  1.主持和参加的主要项目  156
  2.攻读博士学位期间发表论文情况  156-158
  3.攻读博士学位期间专利申请情况  158

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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