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小麦抗病相关基因的转化及瞬间表达研究

作　者: 王华忠
导　师: 陈佩度
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦 白粉病 抗病相关基因 瞬间表达 转基因
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 352次
引　用: 2次
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内容摘要


小麦是我国乃至世界的重要粮食作物。小麦真菌病害是影响小麦产量的重要因素。随着植物分子生物学和功能基因组学的快速发展,我们对植物复杂的抗病反应过程有了越来越清晰的了解。同时,越来越多的抗病和抗病反应过程相关基因的克隆也成为可能。对这些基因进行功能鉴定和抗病效果分析,并利用基因工程手段开展小麦抗病分子育种将具有广阔的前景。结合传统的育种方法,对小麦抗病性状的改良将更为快速和高效。本实验首先利用基因枪转化方法,将两个抗病相关基因TaTBL和TaTST转入到感病小麦品种杨麦158中,获得经过分子鉴定和抗性分析的转化植株。随后,又利用瞬间表达技术对TaTBL、TaPK1、TaTST、G1b3s2、Cht4和G1b3s6等6个抗病相关基因的功能进行了分析,表明其在感病小麦叶片表皮细胞中的过量表达能显著抑制白粉菌对细胞的侵入和吸器的形成,提高表达细胞的抗性。 1.1 小麦抗病相关基因的转化 利用花青素合成酶调节基因作为报告基因对影响基因枪转化的多个参数进行了深入的分析,优化了转化过程。随后,分别构建了两个抗病相关基因小麦类Beclin1基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST的植物高效表达载体,目标基因的启动子为来源于玉米泛素基因的单子叶植物高效启动子ubi,植物选择标记基因为除草剂抗性基因bar。使用基因枪将表达载体分别导入到再生频率较高的感白粉病小麦品种杨麦158的幼胚愈伤组织细胞中。轰击后经过两轮除草剂bialaphos筛选和抗性愈伤组织的再生,分别获得转TaTBL基因的抗性植株50株;转TaTST基因的抗性植株30株。提取抗性植株基因组DNA,分别依据bar基因、Ubi启动子和目标基因的序列设计并合成引物进行PCR扩增,结果分别有6株和5株能够同时正确扩增出bar基因、Ubi启动子和相应的目标基因TaTBL或TaTST基因片断,初步表明外源基因确已整合到了小麦基因组上。转化植株苗期离体叶片的白粉病接种实验表明,TaTBL和TaTST基因的导入,在一定程度上增强了转化植株对白粉菌的抗性,表现为延缓了白粉菌的发育。 1.2 小麦抗病相关基因的瞬间表达研究 采用瞬间表达技术分析了小麦类Beclin1基因TaTBL、丝氨酸/苏氨酸激酶基因TaPK1、硫代硫酸硫转移酶基因TaTST、β-1,3-葡聚糖苷酶基因G1b3s2、几丁质酶基

全文目录


中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
第一篇 文献综述  11-55
  第一章 小麦转基因技术的发展及应用  11-44
    1 植物转基因技术的发展及应用  11-16
      1．1 植物基因转化的发展  11-12
      1．2 植物转基因技术的应用  12-15
        1．2．1 转基因育种(分子育种)  12-13
        1．2．2 功能基因组研究  13-14
        1．2．3 植物生物反应器  14-15
      1．3 植物基因转化的新兴技术  15-16
    2 小麦基因转化研究现状与展望  16-44
      2．1 小麦基因转化方法  16-33
        2．1．1 基因转化对小麦组织培养的要求  16-18
        2．1．2 基因枪法  18-26
        2．1．3 农杆菌介导的转化体系  26-31
        2．1．4 其它转化方法  31-33
      2．2 小麦基因转化过程中报告基因和选择标记基因的使用  33-35
      2．3 外源基因在转基因小麦中的表达与表达分析  35-37
      2．4 转基因小麦的应用  37-41
      2．5 小麦基因转化存在的问题及解决策略  41-43
      2．6 转基因小麦的展望  43-44
  第二章 植物瞬间表达系统的发展与应用  44-55
    1 外源基因在植物细胞内的瞬间表达  44
    2 瞬间表达的方法  44-46
    3 瞬间表达技术的应用领域  46-53
      3．1 植物抗病基因克隆  46-47
      3．2 转录元件和转录因子的克隆与分析  47-48
      3．3 基因性质、功能及互作分析  48-51
      3．4 基因产物定位分析  51-52
      3．5 基因结构与功能的关系  52
      3．6 创造植物组织生物反应器  52-53
    4 瞬间表达系统应用中应注意的问题  53-54
    5 瞬间表达系统的应用前景  54-55
第二篇 研究报告  55-97
  第三章 小麦抗病相关基因的转化  55-78
    1 材料与方法  57-63
      1．1 技术路线  57
      1．2 转化受体  57-58
      1．3 种子消毒  58
      1．4 培养基  58
      1．5 基因及载体构建  58-60
      1．6 无内毒素质粒DNA的提取  60-61
      1．7 基因枪转化过程  61
      1．8 分子鉴定  61-63
      1．9 转基因植株的抗病性鉴定  63
    2 结果与分析  63-76
      2．1 表达载体的构建  63-66
      2．2 小麦愈伤组织的诱导  66-67
      2．3 幼胚愈伤组织的除草剂敏感性分析  67
      2．4 利用瞬间表达优化基因枪转化参数  67-71
      2．5 稳定转化及除草剂抗性植株的筛选及再生  71-73
      2．6 转基因植株的分子鉴定  73-75
      2．7 转基因植株的抗病性分析  75-76
    3 讨论  76-78
      3．1 小麦幼胚愈伤组织的诱导  76-77
      3．2 基因枪转化  77
      3．3 抗性愈伤组织的筛选及再生  77
      3．4 利用转基因技术提高小麦的抗病性  77-78
  第四章 小麦抗病相关基因的瞬间表达研究  78-97
    1 材料与方法  80-84
      1．1 实验材料  80-81
      1．2 实验方法  81-84
        1．2．1 质粒提取、酶切、连接及电击转化  81
        1．2．2 载体构建  81-82
        1．2．3 离体叶片的转化  82
        1．2．4 接种与互作  82-84
    2 结果分析  84-94
      2．1 表达载体的构建  84-85
      2．2 白粉菌的发育过程  85
      2．3 报告基因在表皮细胞中的表达  85-86
      2．4 两基因共表达和GUS基因产物对白粉菌侵染的影响  86
      2．5 目标基因与白粉菌的互作效果  86-94
    3 讨论  94-97
全文结论  97-98
论文创新点  98-99
参考文献  99-116
致谢  116

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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