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苜蓿中华根瘤菌耐盐分子机制的研究

作　者: 魏巍
导　师: 杨苏声
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苜蓿中华根瘤菌 Tn5-1063 突变耐盐功能互补
分类号: S154.381
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 344次
引　用: 1次
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内容摘要

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM分离自新疆的和田苜蓿,能够在含0.6mol/LNaCl的FY基本培养基中生长。通过构建Tn5-1063插入突变体库,从20,000多株突变株中得到8株盐敏感突变株W2、W4、W8、W10、W11、W15、W19和E4。耐盐性试验表明,它们都不能在含有0.4mol/L NaCl的FY培养基中生长,在0.3mol/L LiCl的FY培养基中不能生长;其中,W15在含有0.1mol/L LiCl的FY培养基上不能生长;W8,W10在含有0.2mol/L LiCl的FY培养基上不能生长。除W4外,其余突变株在相同渗透压下,对葡萄糖所造成的渗透压不敏感,只对盐造成的渗透压敏感,进一步证明它们是盐敏感而非渗透压敏感,同时对温度和pH的耐受性没有改变。以转座子内的基因luxAB为探针进行Southern杂交,发现Tn5在这8个突变株中都只有单一拷贝的插入,表明突变株的盐敏感表型是由于转座子插入诱变造成的。对Tn5插入位点侧翼序列进行克隆、测序,得到7个与耐盐有关基因,在Genbank的登录号为AY502026-AY502032。经分析,在W2中,Tn5插入在染色体基因greA中,此基因编码细菌转录切割因子;在W4中,Tn5插入在基因omp10内部,该基因编码细菌外膜蛋白:在W11中,Tn5插入在基因relA内部,该基因编码鸟苷五磷酸合成酶;在W15中,Tn5插入在基因nuoL内部,此基因编码NADH呼吸链L亚基蛋白;在W19中,Tn5插入在编码核酸酶、解旋酶基因的内部,该基因与DNA的复制和修复有关;在W8和W10中,Tn5插入在基因SMc02759内部,该基因功能未知:在E4中,Tn5插入在基因SMc00709内部,基因功能未知。根据W2测序结果,PCR扩增得到包含greA基因启动子的全长区段,将其克隆至穿梭载体pBBR1MCS-5上,三亲本杂交将完整的greA基因转入突变株W2中,使突变株恢复耐盐性,证明greA基因是一种与耐盐有关的转录切割因子基因。根据W11测序结果,PCR克隆了relA基因ORF,克隆到表达载体pET—28a,并转入E.coli的relA突变株中,实验表明,该基因有效地恢复了E.coli的relA突变株在选择性培养基上的生长,而空载体的对照则无法生长,从而有力地证明了relA基因的功能。同时,结瘤实验表明,relA基因的突变导致了042BM的结瘤缺陷。PCR扩增得到包含启动子的relA基因全长,将其克隆至穿梭载体pBBR1MCS-5上。三亲本杂交将完整的relA基因转入突变株W11中,使突变株恢复耐盐性,进一步表明relA基因是一种重要的与耐盐有关的基因。根据实验结果,我们认为,S.meliloti 042BM的耐盐性涉及到:1)全细胞调控水平;2)大分子(如DNA)代谢水平;3)某些与抗逆有关的特殊物质的合成;4)能量代谢及离子转运系统;5)维持细胞整体结构的水平,反映出多基因的网络调控机制。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
Abbreviation  8-9
第一章绪论  9-37
  1.1 本论文研究的理论和应用意义  9-10
  1.2 根瘤菌分子遗传学的研究进展  10-12
  1.3 细菌耐盐机制的研究进展  12-35
  1.4 转座子标签技术  35-36
  1.5 本论文的研究路线与目标  36-37
第二章苜蓿中华根瘤菌042BM盐敏感突变株筛选及生理研究  37-50
  2.1 前言  37
  2.2 材料与方法  37-45
  2.3 结果  45-49
    2.3.1 盐敏感突变株的获得及耐盐性分析  45
    2.3.2 Tn5-luxAB探针的设计和制备  45-46
    2.3.3 突变株中Tn5插入的验证  46-47
    2.3.4 pH值、温度变化对盐敏感突变株的影响  47
    2.3.5 盐敏感突变株在其它渗透压条件下的生长  47-49
  2.4 讨论  49-50
第三章苜蓿中华根瘤菌042BM与耐盐有关基因的克隆与分析  50-63
  3.1 前言  50
  3.2 材料与方法  50-53
  3.3 结果  53-61
    3.3.1 转座子Tn5插入位点侧翼序列的克隆策略  53
    3.3.2 基因克隆  53-54
    3.3.3 Tn5插入位点两端DNA片段的序列分析  54-58
    3.3.4 盐敏感突变株中Tn5插入的定位分析  58-61
  3.4 讨论  61-63
第四章 greA基因的克隆及功能互补研究  63-75
  4.1 前言  63
  4.2 材料与方法  63-66
  4.3 结果  66-73
    4.3.1 042BM greA基因全长的获得  66-70
    4.3.2 含042BM greA基因的重组质粒pMCS5G的构建  70-72
    4.3.3 042BM greA基因的功能互补研究  72-73
  4.4 讨论  73-75
第五章 relA基因的克隆及功能研究  75-90
  5.1 前言  75
  5.2 材料与方法  75-78
  5.3 结果  78-89
    5.3.1 042BM relA基因全长的获得  78-79
    5.3.2 relA的序列分析  79-84
    5.3.3 对大肠杆菌relA突变株互补的研究  84-85
    5.3.4 对盐突变株W11互补的研究  85-88
    5.3.5 relA突变对042BM结瘤的影响  88-89
  5.4 讨论  89-90
结论  90-91
参考文献  91-110
致谢  110-111
作者简介  111

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