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结核DNA疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究

作　者: 朱中元
导　师: 张春发
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 分枝杆菌 结核 疫苗 DNA 真核表达载体构建 细胞因子测定 C57BL/6小鼠 保护力
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


结核病仍对人类健康构成重要威胁。全球现有TB患者近3000万，每年病死数近300万。结核病唯一可用的免疫预防制剂是BCG。它的免疫保护力介于0-80％之间，WHO的调查研究表明其保护力也仅为50％。成年人及老年人并不能得到BCG的有效保护。BCG对热敏感，在运输、贮存中需要低温保存。因此寻找新型高效，效果稳定的疫苗一直是相关领域研究人员关注的热点。 本研究的目的，是设计和构建真核表达结核菌蛋白的载体即DNA疫苗，并对其免疫功能及保护力进行研究。所设计构建的10种结核DNA疫苗依次为TB-V1，表达结核菌Mtb8.4；TB-V2，表达结核菌Ag85B蛋白；TB-V3，表达Mtb8.4、38kDa的Th表位和CTL表位以及Ag85B的融合蛋白；TB-V4，表达GST和Mtb8.4的融合蛋白；TB-V5，表达GST与Ag85B的融合蛋白；TB-V6，表达含hIL-2信号肽的Mtb8.4；TB-V7，表达含信号肽的Ag85B；TB-V8，表达含信号肽的Mtb8.4、38kDa蛋白的CTL／Th表位以及Ag85B成熟蛋白的融合蛋白；TB-V9，表达信号肽的Mtb8.4与GST的融合蛋白；TB-V10，表达含信号肽的Ag85B与GST的融合蛋白。TB-V6-TB-V10等5种载体，均在表达结核蛋白的N末端插入hIL-2的信号肽。p-hIL2质粒表达hIL-2；p-hIL2s质粒仅表达hIL-2的信号肽，作为对照。 所构建的12种质粒DNA，经PCR、酶谱鉴定后，并对插入表达目的的DNA片段进行了测序分析，表明所构建的12种载体质粒与构建设计准确无误。 p-hIL2、p-IL2s、TB-V6、TB-V7、TB-V8、TB-V9与TB-V10质粒DNA，以0.1M PBS将其分别稀释成1mg／mL溶液，除菌，然后分别在0d、15d和30d，分3次在8-10周龄的雌性C57BL／6小鼠四肢肌肉各注射0.1mL(100 μg／只小鼠)。对照组为等剂量的pVAX1、D-IL2s、PBS溶液。阳性对照组为BCG，以10~5CFU注射小鼠皮内，与其他小鼠初免时一同免疫，该组每只小鼠只免疫1次。疫苗免疫组、对照组共12组，分别是TB-V6～TB-V10等5组，p-IL2质粒注射组，TB-V6+p-hIL22作者:华南热带农业大学博士研究生朱中元，导师:张春发和TB一7+，hILZ联合免疫2组(每种质粒各50 ug免疫)，PBs，BcG，pVAXI和尸LZs共4个对照组。每组10只小鼠。 在最后一次DNA疫苗加强免疫15天后，杀死每组的其中5只小鼠，取脾磨成匀浆，并用10%FCS RPMll64O培养基将脾淋巴细胞配成10VmL浓度，加入到24孔培养板中，200 pl吼，5%Cq条件下培养72h，上清经ELIsA法测定鼠白细胞介素一(mIL一2)、而L-6、而L一10和鼠7干扰素(mIFN斗)。处死小鼠时采血，用于测定hIL一2。 在DNA疫苗最后一次加强免疫的21天，将结核菌H37RLv株培养约20天的细菌磨成悬液，取106/0.llnL菌经尾静脉注射实验感染每组剩下的5只小鼠。感染15天后，杀死所有小鼠，取脾、肝和肺分别称重，制成匀浆，接种0.lmL于改良罗氏培养基(L一)培养瓶，置37C培养20一30天，计数。并根据器官重量和稀释倍数，换算出每种器官培养物的CFUlg。每个小鼠的每种器官各接种3支L一培养，取其均数作为最后结果。 检测各免疫组、对照组的上清中的而L一2，而L一6，而L一10和而FN斗以及血清中hIL一2的含量，显示TB一v6，TB一V7，TB一vs，TB一vg，TB一V10，TB一v6+P扣L2，TB一v7+p扣L2及p一hILZ等8个免疫组的mIFN斗及mIL一显著高于pVAXI，PBs和p一LZs质粒对照组，与BCG免疫组的水平稍低或相当。其中p.hiLZ注射组，TB一v6+p-hiLZ以及犯一7+p一址LZ联合免疫组小鼠血清hIL一2水平显著升高。而这8组的体外淋巴细胞培养上清中的nilL一6及mIL一10的含量不升高或升高不明显。表明犯J6~TB一vlo等5种DNA疫苗及p扣LZ表达载体能够刺激预防结核病所需的几1型免疫应答。 TB一6~TB一V10等5种疫苗免疫的5只小鼠的脾结核菌载量分别为44 1 68、28400、1 8597、34703和22954CFIJ/g。TB一v6+P一LZ和TB一V7+P一L2联合免疫组和p一hILZ注射组的脾结核菌载量分别为12471、34x57和51339 CFU/g。对照组邓S、pVAXI、p一LZs及BCG的脾细胞悬液的结核菌计数结果均数分别是:61012、60716、69395和1 1 164CFU/g。表明本研究中构建的，IB一6~TB一v10等疫苗具有减少免疫鼠经H37Rv攻击后脾脏结核菌载量，且TB一vs疫苗，TB一v6+P一砚联合免疫，产生的保护力与BCG免疫产生的保护力非常接近。为进一步研究这些疫苗防止大动物感染结核菌H37Rv的实验研究奠定了基础。 我们在结核DNA疫苗的构建设计中使用了hIL一2信号肤序列，并采用表达hIL.2的质粒与TB DNA疫苗联合免疫及构建表达融合蛋白(GST)的疫苗，并获得与BCG非常接近的保护力。均为TB DNA疫结核D队疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究」苗研究首次报道。取得了预期的研究结果，对其他疫苗的研究有指导参考价值。 结论:1.所构建的表达结核菌蛋白或融合蛋白的载体:邓一1、TB一2、TB~V3、TB.V4、TB~VS、TB一V6、TB~V7、TB一VS、TB一Vg、TB一V10、表达bIL.2的载体卜拍LZ和表达hiL一2信号肤的载体尸LZs等经抗性筛选、酶谱鉴定及DNA序列分析，结果表明12种DNA疫苗表达载体质粒的构建均与设计要求准确无误。2.TB一6、TB一V7、TB一7、TB一VS、TB一Vg与TB一V105种DNA疫苗单独免疫，或者

全文目录


中文摘要  6-9
Abstract  9-12
Ⅰ 引言  12-15
Ⅱ 结核病的免疫预防及新型疫苗研究进展(文献综述)  15-31
  1 核病的免疫预防史回顾  15-19
  2 BCG预防结核病的成效及存在的问题  19-20
  3 流行病学形势及对新型高效制剂的要求  20-21
  4 结核病新型疫苗的研究进展  21-29
  5 DNA疫苗研究存在的误区  29
  6 研发前景及展望  29-31
Ⅲ 表达结核菌抗原真核表达载体构建、鉴定  31-73
  1 材料与方法  31-58
    1.1 结核菌H37Rv标准株(ATCC27294)  31
    1.2 L-J培养基配方及配制方法  31
    1.3 结核菌基因组DNA的提取  31
    1.4 转化细菌质粒DNA的提取(供PCR用)  31-32
    1.5 PCR试剂等  32
    1.6 pVAX1真核表达载体  32
    1.7 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 α及JM109菌株  32
    1.8 pGex-2T载体  32
    1.9 Ex Taq DNA酶  32
    1.10 PCR反应体系  32
    1.11 PCR扩增程序  32-33
    1.12 基因扩增仪  33
    1.13 质粒DNA的提取  33
    1.14 PCR片段的回收  33-34
    1.15 回收的PCR片段与T-载体连接  34
    1.16 感受态细胞的制备  34-35
    1.17 重组质粒转化感受态细胞  35
    1.18 建立测序克隆载体的主要步骤  35-36
    1.19 构建的真核表达载体的基因测序分析  36-38
    1.20 质粒载体或中间载体的DNA序列分析  38
    1.21 本研究中所构建的DNA疫苗代码  38
    1.22 hIL-2基因  38-40
    1.23 表达结核菌Mtb8.4蛋白的真核表达载体(TB-V1)构建过程  40-42
    1.24 表达结核菌Ag85B蛋白真核表达载体(TB-V2)构建过程  42-43
    1.25 表达结核菌Mtb8.4、38kDa的CTL表位和Ag85B融合蛋白的真核表达载体(TB-V3)的构建步骤  43-45
    1.26 表达GST-MTB8.4融合蛋白真核表达载体(113-V4)的构建过程  45-46
    1.27 表达GST-Ag85B融合蛋白真核表达载体(TB-V5)的构建步骤  46-47
    1.28 p-IL2s质粒载体的构建  47-48
    1.29 TB-V6疫苗的结构及构建过程  48-49
    1.30 TB-V7 DNA疫苗的基因结构及构建  49-50
    1.31 TB-V8 DNA疫苗的结构及构建步骤  50-51
    1.32 TB-V9 DNA疫苗的构建过程  51-53
    1.33 TB-V10 DNA疫苗构建  53-55
    1.34 表达人白细胞介素-2的真核表达载体(p-hIL2)的构建  55-58
  2 结果  58-66
    2.1 TB-V1质粒表达载体的构建结果  58
    2.2 TB-V2质粒表达载体的构建结果  58-59
    2.3 TB-V3质粒表达载体的构建结果  59-60
    2.4 TB-V4质粒表达载体的构建结果  60-61
    2.5 TB-V5质粒表达载体的构建结果  61
    2.6 TB-V7表达载体的构建的结果  61-62
    2.7 TB-V6真核表达载体的结果  62-63
    2.8 TB-V8的真核表达载体构建的结果  63-64
    2.9 TB-V9疫苗构建结果  64
    2.10 TB-V10的构建结果  64-65
    2.11 p-hIL2质粒的构建结果  65-66
  3 讨论  66-73
Ⅳ 结核DNA疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞产生细胞因子水平观察  73-89
  1 材料与方法  73-77
    1.1 结核DNA疫苗的制备  73-74
    1.2 质粒DNA制备、提取和纯化等有关试剂配制  74-75
    1.3 主要试验材料  75
    1.4 细胞因子检测方法  75-76
    1.5 培养基上清中鼠白细胞介素-2的测定  76
    1.6 mIL-10的定量测定方法  76
    1.7 mIL-6的定量检测  76
    1.8 鼠干扰素(interferon-γ，mIFN-γ)的测定  76
    1.9 C57BL／6的免疫程序  76-77
    1.10 BCG  77
  2 结果  77-85
    2.1 5种细胞因子标准曲线的直线回归方程、相关系数及其显著性检验  77-78
    2.2 5种DNA疫苗免疫或者联合免疫组的小鼠产生的hIL-2的水平比较  78
    2.3 5种DNA疫苗免疫或者联合免疫的小鼠脾细胞体外产生的mIFN-γ的水平比较  78-79
    2.4 5种DNA疫苗免疫或者联合免疫的小鼠的脾细胞体外产生的mIL-2的水平比较  79-80
    2.5 5种DNA疫苗免疫组或者联合免疫组小鼠的脾细胞体外产生的mIL-6水平比较  80
    2.6 5种结核DNA疫苗免疫组或联合免疫组C57BL／6小鼠的脾淋巴细胞产mIL-10的水平  80-81
    2.7 TB-V6(表达结核菌Mtb8.4蛋白的DNA疫苗)免疫小鼠的细胞因子水平  81
    2.8 TB-V7免疫组产生的细胞因子比较  81-82
    2.9 TB-V8免疫组产生的细胞因子水平  82
    2.10 TB-V9 DNA疫苗免疫组mIL-2产生的水平  82-83
    2.11 TB-V10 DNA疫苗免疫组mIL-2产生的水平  83
    2.12 p-hIL2真核表达载体注射C57BL／6小鼠的脾淋巴细胞产生细胞因子情况和血清中hIL-2水平  83-84
    2.13 p-hIL2与TB-V7联合免疫的细胞因子变化  84
    2.14 p-hIL2与TB-V6联合免疫的细胞因子水平变化  84-85
  3 讨论  85-89
Ⅴ 结核DNA疫苗免疫小鼠抵抗结核菌H_(37)Rv株攻击的实验观察  89-100
  1 材料与方法  89-90
  2 结果  90-96
    2.1 构建的5种结核菌DNA疫苗保护免疫小鼠的作用比较  90
    2.2 以Mtb8.4为主要表达抗原的TB DNA疫苗的免疫效果  90-91
    2.3 以结核菌Ag85B为主要抗原的DNA疫苗的免疫保护作用  91
    2.4 表达hIL-2的真核表达载体及其与其他DNA疫苗的联合免疫保护效果比较  91-92
    2.5 结核DNA疫苗免疫鼠脾淋巴细胞体外产生的细胞因子的含量与疫苗免疫后抵抗结核菌H37Rv侵袭的关系  92-93
    2.6 小鼠肝脏和脾脏结核菌载量  93
    2.7 12个免疫或对照组结核菌菌落图片  93-96
  3 讨论  96-100
    3.1 目前已有结核DNA疫苗的免疫效果简单回顾  96-97
    3.2 BCG免疫存在的主要问题及疫苗研究发展的方向  97
    3.3 实验的5种疫苗的保护作用评价  97
    3.4 表达融合抗原的免疫效果  97-98
    3.5 与表达细胞因子的载体联合免疫策略  98
    3.6 细胞因子水平与保护力之间的关系  98-99
    3.7 该研究的价值  99-100
Ⅵ 结论  100-101
参考文献  101-110
致谢  110-111
附录 本文涉及的缩写及术语简表  111-113

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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