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伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DNA疫苗及VP22蛋白转导的免疫增强效应研究

作　者: 肖少波
导　师: 陈焕春；熊远著
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 伪狂犬病毒 gC基因克隆表达 “自杀性”DNA疫苗 VP22 蛋白转导免疫增强
分类号: S852.5
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

伪狂犬病(Pseudorabies)是当今危害养猪业的最重要传染病之一，免疫接种仍是目前控制和预防该病的主要手段。传统的猪伪狂犬病疫苗对控制疾病的发生和流行发挥了巨大作用，但存在毒力返强的安全隐患或免疫效果不佳等缺陷。研制更安全、高效、廉价的新型疫苗一直是伪狂犬病研究的重要方向。 “自杀性”DNA疫苗(Suicidal DNA vaccine)是基于常规DNA疫苗和“自主复制型”RNA疫苗(Self-replicating RNA vaccine)基础上发展起来的一种全新的疫苗设计，不仅具有“自主复制型”RNA疫苗的安全性与高效性，而且结合了常规DNA疫苗易制备、保存等方面的优点，还能突破免疫耐受，堪称近年来基因疫苗发展的重大突破，具有巨大的开发潜力与良好的应用前景。作为重要的动物病毒性疾病，伪狂犬病的常规DNA疫苗得到了广泛开展，但“自杀性”DNA疫苗研究迄今尚未见报道。蛋白转导(Protein transduction)是近年来生命科学领域发现的一种独特的现象，其高效的跨膜转运功能和在细胞间自主传递的特点，不仅彻底打破了传统的基因转移模式，而且为人类基因治疗和新型疫苗研究提供了新的思路。来源于人单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)和马立克氏病毒Ⅰ型(MDV-1)的间质蛋白VP22先后被证实具有蛋白转导特性，并能显著提高DNA疫苗和“自主复制型”RNA疫苗的免疫反应。但与HSV-1、BHV-1和MDV-1同属α-疱疹病毒亚科的伪狂犬病毒(PrV)VP22是否也具有相似的蛋白转导特性目前尚不清楚。如果具有，它们之间是否在转导能力上存在差异?此外，VP22的蛋白转导是否也能增强“自杀性”DNA疫苗的免疫效力?对这些问题的研究不仅可丰富蛋白转导的理论体系，拓宽蛋白转导的应用范围，而且还有望阐明α-疱疹病毒VP22蛋白转导的作用机理，为人类基因治疗和新型高效疫苗研究提供更有效的工具。鉴于上述研究背景，本研究探讨了伪狂犬病毒最主要的保护性抗原基因gC基因“自杀性”DNA疫苗的免疫原性和保护效力；研究了伪狂犬病毒VP22的蛋白转导特性；比较了4种VP22的蛋白转导特性及其增强DNA疫苗免疫反应的差异并筛选了增强效果最好的VP22；评价了所筛选的VP22增强不同分子量大小的模式抗原以及PrVgC基因“自杀性”DNA疫苗免疫反应的能力。主要研究内容如下： 1．PrV Ea株gC基因的克隆与序列分析从PrV Ea株基因组DNA中通过酶切和Southern杂交克隆了完整的gC基因并进行了序列测定、糖基化位点和抗原表位预测、进化系统分析与序列比较，发现PrV Ea株gC基因可编码487个氨基酸残基，分别较具有代表性的国外分离株NIA-3株和S-81株长8个和9个氨基酸。有意义的突变是在第65位氨基酸处连续插入7个氨基酸残基并形成新的潜在抗原表位。同时，Ea株gC与牛源毒Fa株呈高度同源性和编码相同数量的氨基酸，提示这两种来源不同毒株可能存在很近的亲源关系。伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DN人疫苗及vP22蛋白转导的鱼座增鱼塑塑迷2.gC基因在大肠杆菌中的高效表达与gC一EL工SA方法的建立以pET一28a为载体，构建了gC基因的原核表达pETCI .5，经工PTG诱导在大肠杆菌BL21(D E3)中获得高效表达，表达蛋白的分子量约为62 kDa，主要以包涵体形式存在，western blot检测证实具有良好的反应原性。进一步将表达蛋白进行纯化与复性，建立了以重组gC蛋白为抗原的gC一ELISA，与中和试验的符合率为81.8%。3.伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DNA疫苗的免疫保护分别以pcDNA3.卜和pSFV一DNA为载体，构建了gC基因的常规DNA疫苗表达质粒peDC和“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSFVCI.5，转染BHK一21细胞，western blot检测证实两种表达质粒均能正确表达gC，而且pSFVCI.5还能诱导转染细胞发生细胞凋亡。将pSFVCI.5和peDC分别以10，g/只免疫BALB/e小鼠，发现常规DNA疫苗产生的EL工SA抗体和中和抗体均明显高于“自杀性”DNA，但“自杀性”DNA能诱导更强的细胞免疫。二免后4周采用5x105 pfu的PrVEa株强毒攻击，“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗的保护率分别为1 00%和62.5%，说明“自杀性”DNA疫苗能提供更好的免疫保护。4.伪狂犬病毒VP22蛋白转导特性构建了PrV VP22(PVP22)与绿荧光蛋白突变体mut4EGFP融合的真核表达质粒pePM4，转染Hela细胞并与mut4EGFP非融合表达质粒(peM4)进行比较，发现PVP22一mut4EGFP融合蛋白的荧光呈多种分布，但主要以颗粒的形式分布在核或核外周，也有部分细胞的荧光呈胞浆分布，而pcM4转染细胞的荧光全部呈弥漫型，分布于整个细胞。进一步构建了同时表达PVP22一mut4EGFP融合蛋白和红色荧光蛋白(DSRed2)非融合蛋白的双顺反子表达质粒pcP4RFP，利用绿荧光蛋白和红色荧光蛋白双标记检测PVP22的蛋白转导作用，证实PVP22具有蛋白转导特性，但在活细胞中蛋白转导检测比较困难，甲醇固定能明显提高蛋白转导检测的敏感性。将瞬时转染peP4RFP的Hela细胞按l:20比例分别与未转染的CHO一Kl和BHK一21细胞混合培养8h，在甲醇固定下，可观察到表达PVP22一mut4EGFP融合蛋白的Hela细胞周围的CHO一K1细胞或BHK一21细胞也发绿色荧光，证实PVP22具有在不同种属来源细胞间进行蛋白转?

伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DNA疫苗及VP22蛋白转导的免疫增强效应研究

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