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芸苔属蔬菜重金属累积特性及抗Cd基因的差异表达与克隆

作　者: 王松良
导　师: 郑金贵
学　校: 福建农林大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 芸苔属蔬菜小白菜 Cd Cd抗性 Cd耐性植物修复食品卫生品质半胱氨酸合成酶
分类号: S63
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

镉（Cd）位列重金属“五毒”（Cd、Hg、As、Cr、Pb）之首，是人体最危险的致癌物之一，最易在肾和骨骼中大量积累，导致肾功能衰竭、骨软化和骨碎。我国有严重Cd污染农田，分布在包括福建省在内的11省区。与其它“四毒”相比，进入土壤的Cd主要分布在耕作层，一般不被土壤固定，易于被作物吸收，蔬菜茎叶可食部位更容易累积Cd。我国蔬菜总产量年3.45亿t，位居世界第一。城乡菜篮子基地大多位于城郊工业区，蔬菜用地普遍受城乡工业污染，各大城市蔬菜Cd含量平均超国家卫生标准的2-3倍，最高达5.2倍。入世后，属于劳动密集型的、易于出口创汇的蔬菜产业，却因其卫生品质问题，削弱其在国际市场的竞争力。治理Cd污染土壤、降低蔬菜Cd含量，迫在眉睫。本研究以24个芸苔属蔬菜基因型为材料，期望从蔬菜种质资源中筛选出：①抗Cd基因型即Cd低累积基因型用于低Cd含量、高卫生品质蔬菜育种与生产；②耐Cd基因型即Cd高富集基因型用于Cd污染土壤修复。主要结果如下： 1．研究出易于控制误差的温室水培试验体系：应用蛭石代替土壤育苗，以去离子水代替自来水配制营养液，以塑料网兜、珍珠岩石和塑料泡沫等简易材料固定植株，探索出易于控制蔬菜重金属离子误差的温室水培试验体系； 2．小白菜茎叶食用部位是Cd累积和分配的部位：在125μmol．L^-1的Cd、Pb、As等3种重金属浓度胁迫下，13个小白菜基因型茎叶平均Cd含量为373.34mg．kg^-1(国家卫生安全标准高限为0.20 mg．kg^-1)，分别是Pb(62.20 mg．kg^-1，国家卫生安全标准高限为0.40 mg．kg^-1)和As(27.56 mg．kg^-1，国家卫生安全标准高限为0.70 mg．kg^-1的6.0和13.6倍。说明Cd比Pb、As更易在茎叶食用部位累积，也说明了小白菜食用部位（茎叶）是Cd累积和分配的部位。 3．筛选出抗Cd和耐Cd的小白菜基因型：设置不同Cd胁迫浓度，结合最适合的胁迫浓度和生理生化耐性指标研究，筛选出小白菜抗Cd基因型（低累积）“Dr-SHQ”和耐Cd基因型（高富集）“Kt-RBD”。在50umol．L^-1 Cd胁迫下，二者茎叶Cd含量分别为114.87和699.92 mg．kg^-1，后者是前者4.97倍，分别是13个小白菜基因型茎叶平均含量的36.8％和182.62％；其Cd耐性指数分别达到97.8％和91.5％，说明两个基因型在Cd胁迫下都能正常生长，可分别作为低Cd含量、高卫生品质蔬菜育种和Cd污染土壤修复的材料。 4．检测到小白菜茎叶Cd低累积和高富集相关的RAPD标记：小白菜茎叶Cd低累积RAPD标记长度1个，长度是350bp；高富集RAPD标记1个，长度为610bp；以及结球甘蓝茎叶高富集RAPD标记1个，长度为470bp。说明芸苔属蔬菜茎叶食用部位cd累积特性的差异有其遗传背景，在Cd胁迫下，“Dr一sllQ”和 “Kt一RB护的抗、耐Cd基因都得到表达. 5.获得5个小白莱cd杭、耐性基因差异表达片段:Cd胁迫下，研究“Dr一SIIQ’’和“Kt一RB护的Cd杭、耐性基因的差异表达，结果共获得23个差异片段。其中Cdd3、cdds、Cddl6等3个差异表达片段与同属于芸苔属植物的印度芥菜、拟南芥等重金属解毒代谢的限速酶一半耽氛酸合成酶的编码基因同源性达 81%一96%;片段cdd15与编码金属硫蛋白合成酶基因有78%的同源性;片段cdd18与重金属解毒代谢的另一个限速酶一Y一谷氛酸一半脱氛酸合成酶基因高度同源（92%）。上述5个差异片段除了Cdds来源于基因型“Kt一RBD”外，其它4个均源于基因型 “Dr一SHQ”.说明cd杭性和耐性既有共同的解毒代谢，又存在不同的表达机制，值得深入探讨. 6.半耽氛酸合成酶编码基因的克隆:以“Dr一sHQ”和“Kt一RBD”的cDNA为模板，通过特异引物PCR扩增，从“Dr一SHQ”的。DN^中获得长度sz7bp（wl）的特异条带，从“Kt一RBD"eDNA中获得长度为528bp（WZ）和810bp（W3）2条带.其中W1与wZ仅有5个碱基的差异，二者与印度芥菜、拟南芥等植物编码半脆氨酸合成酶的cDN人有99%一92%的同源性.说明已从小白菜中克隆到半耽氨酸合成酶编码基因cDNA的保守片段，为其全基因序列的克隆以及深入研究小白菜杭Cd的分子机制、耽氨酸合成酶的表达与功能莫定了基础.

全文目录

中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
第一章研究概述与研究意义  13-37
  本章摘要  13
  一、引言  13-14
  二、相关研究概述  14-29
    1 环境重金属污染物与植物食品安全  14-20
      1.1 威胁植物食品安全的主要因素  14-15
      1.2 植物食品的重金属累积状况与特点  15-20
    2 植物对重金属累积特性研究概述  20-26
      2.1 用于高卫生品质育种材料的重金属低累积作物种质资源筛选  21-22
      2.2 用于修复土壤重金属污染土壤的高累积植物种质资源筛选  22-26
      2.3 用于环境重金属污染监测的敏感型植物种质资源筛选  26
    3 植物(作物)对重金属的忍耐防御机理研究  26-27
    4 问题与展望  27-29
  三、研究意义与主要研究内容  29-31
    1 本研究的基本思路与意义  29-30
    2 主要研究内容  30-31
  参考文献  31-37
第二章芸苔属蔬菜对重金属的累积特性  37-57
  本章摘要  37-38
  一、引言  38-40
  二、 13种小白菜对重金属Cd、Pb、As累积特性比较  40-46
    1 材料与方法  40-41
    2 结果与分析  41-44
      2.1 不同基因型、不同部位Cd、Pb、As累积量的差异  41-43
      2.2 Cd、Pb、As在13个小白菜基因型茎叶与根系的累积特点与利用方向  43-44
    3 小结  44-46
  三、芸苔属蔬菜的Cd累积特性及其作为修复Cd污染土壤的潜力研究  46-52
    1 材料与方法  46-47
    2 结果与分析  47-50
      2.1 芸苔属蔬菜不同基因型茎叶Cd累积量的差异  47
      2.2 芸苔属蔬菜的Cd累积特性  47-50
      2.3 芸苔属蔬菜资源作为土壤Cd污染植物修复的潜力  50
    3 小结  50-52
  四、讨论  52-55
    1 重金属对蔬菜的温室营养液胁迫培养方法的改进  52
    2 选择Cd与蔬菜茎叶作为研究对象的意义  52-53
    3 不同Cd累积能力植物资源的筛选指标问题  53
    4 本试验获得的相对极端Cd累积型及其利用  53-54
    5 值得深入研究的方面  54-55
  参考文献  55-57
第三章芸苔属蔬菜Cd耐性形成的生理学机制与RAPD标记  57-79
  本章摘要  57-58
  一、引言  58-61
    1 植物Cd耐性形成的生理机制研究  58-59
    2 分子标记与植物Cd耐性形成  59-61
  二、芸苔属蔬菜的Cd耐性形成的生理学基础  61-68
    1 材料与方法  61-62
    2 结果与分析  62-66
      2.1 不同基因型茎叶Cd含量比较  62
      2.2 不同基因型的Cd耐性分析  62-66
    3 小结  66-68
  三、基于RAPD标记的芸苔属蔬菜Cd累积特性分析  68-74
    1 材料与方法  68-69
    2 结果与分析  69-73
      2.1 DNA提取和RAPD扩增结果  69-70
      2.2 RAPD标记与Cd累积特性和耐性的关系  70-73
      2.3 与Cd累积特性连锁的RAPD标记  73
    3 小结  73-74
  四、讨论  74-76
    1 不同小白菜基因型对Cd的累积能力与其Cd耐性的关系  74
    2 植物Cd耐性的生理学机理  74-75
    3 RAPD分子标记技术是研究植物重金属累积特性与耐性的的重要手段  75-76
  参考文献  76-79
第四章 Cd胁迫下小白菜Cd抗性与耐性基因表达的mRNA差异显示  79-107
  本章摘要  79-80
  一、引言  80-83
    1 本章试验的基本思路  80
    2 基因差别表达研究方法及其在植物抗性基因表达和克隆研究中应用  80-83
  二、 RNA的提取与RT-PCR体系的建立  83-90
    1 材料与方法  83-87
    2 结果与分析  87-89
      2.1 RNA提取与纯化  87-88
      2.2 RT-PCR体系的建立  88-89
    3 小结  89-90
  三、小白菜Cd耐(抗)性基因表达的mRNA差异显示  90-95
    1 材料与方法  90-91
    2 结果与分析  91-94
      2.1 RNA抽提与纯化  91-92
      2.2 不同引物对对4个样品RNA的RT-PCR结果  92-94
    3 小结  94-95
  四、 Cd胁迫下小白菜高耐性mRNA差异片段克隆与序列分析  95-101
    1 材料与方法  95-97
    2 结果与分析  97-100
      2.1 差异片段的二次扩增结果  97-98
      2.2 差异片段的克隆、转化和阳性克隆的筛选  98
      2.3 阳性克隆条带的BLAST与序列分析  98-100
    3 小结  100-101
  五、讨论  101-105
    1 小白菜叶片总RNA的提取  101
    2 本试验对DDRT-PCR技术体系的改进及其问题  101-102
    3 与Cd耐(抗)性相关基因具有高同源性的5个差异条带的表达与功能  102-105
  参考文献  105-107
第五章 Cd胁迫下小白菜谷胱甘肽生化合成限速酶OASTL编码基因保守区克隆与序列分析  107-125
  本章摘要  107-108
  一、引言  108-112
    1 植物对重金属Cd胁迫的分子应答  108-109
    2 克隆方法的选择  109-112
  二、谷胱甘肽生化合成限速酶OASTL编码基因保守区克隆与序列分析  112-121
    1 材料与方法  112-113
    2 结果与分析  113-119
      2.1 退火温度的梯度PCR  113
      2.2 第一次PCR扩增结果  113-114
      2.3 转化产物的PCR阳性克隆鉴定  114
      2.4 特异条带的序列分析  114-117
      2.5 OASTL编码基因的氨基酸序列分析  117-119
    3 小结  119-121
  三、讨论  121-123
  参考文献  123-125
第六章总结与提高  125-132
  本章摘要  125
  一、本研究的主要结果  125-127
  二、重金属耐(抗)性植物筛选、绿色基因与食品安全  127-132
    1 食品安全:21世纪全球共同的主题，发展中国家的首要问题  127-128
      1.1 20世纪“绿色革命”在解决发展中国食物安全问题上的两面性  127-128
      1.2 21世纪发展中国家的食品安全面临新的挑战  128
    2 出路:立足植物资源，充分利用现代生物技术，筛选和转化“绿色基因”，走出食物安全的双重困境  128-131
      2.1 植物资源与绿色基因  129-130
      2.2 抗、耐重金属基因筛选与食品安全  130-131
    3 绿色基因工程:从植物农作走向分子农作  131-132
  三、从挖掘绿色基因角度对本研究后续研究的思考  132
参考文献  132-134
附录1 从小白菜基因型“Dr-SHQ”和“Kt-RBD”克隆获得的OASTL基因保守序列  134-135
附录2 在学期间所主持的课题、发表的论文和获得的成果  135-136
致谢  136

芸苔属蔬菜重金属累积特性及抗Cd基因的差异表达与克隆

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