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深部念珠菌的基因诊断、分子分型及耐药机制研究

作　者: 李劲松
导　师: 宋诗铎；祁伟
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 深部念珠菌感染白色念珠菌分子分型克柔念珠菌基因诊断机制研究光滑念珠菌深部真菌感染外排泵耐药机制
分类号: R379
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

念珠菌是临床重要的条件致病菌，主要包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌等，占深部念珠菌感染的90％以上。由于艾滋病、白血病、肿瘤、粒细胞减少症、器官移植等免疫缺陷或低下患者日益增多，大量使用广谱抗生素、癌症的放疗、化疗、免疫抑制剂、类固醇药物等使患者机体的防御功能降低，合并深部念珠菌感染不断增加。氟康唑等抗真菌药物的广泛使用，使念珠菌属的耐药性日益严重。临床抗真菌药品种有限，念珠菌获得性耐药发展快，常出现交叉耐药，严重危及病人生命。念珠菌对唑类药物的耐药机制包括：药物靶酶的变化及药物外排泵的过度表达。C-14去甲基酶(ERG11)是唑类药物在真菌细胞内作用的靶酶，是麦角固醇(念珠菌细胞膜重要成分生物)合成途径不可缺少的代谢酶，念珠菌在唑类抗真菌药物的选择压力下，由于靶酶基因编码区发生突变，引起酶活性区氨基酸变化和酶三维结构发生改变，导致酶与药物的亲和力及粘附度降低，使得真菌细胞内药物不能有效抑制C-14去甲基酶的催化活性而耐药；或靶酶基因调控区和(或)相应的调节基因发生改变，靶酶基因过度表达，产生大量的靶酶，细胞内药物浓度不能完全抑制靶酶的活性而耐药。多数念珠菌耐药的主要原因是细胞内药物累积量下降。这一变化与多种外排泵基因的过度表达相关。外排泵能将细胞内的药物泵出胞外，导致细胞内药物浓度降低，不能有效抑制念珠菌的生长。念珠菌与唑类药物相关的外排泵基因主要有两大类：一类为ATP结合盒转运子家族(ATP binding cassette transporter)如cdr1、cdr2等基因；另一类是主要易化子超家族(major superfacilitater)的多重耐药基因mdr1。近年来，国内深部真菌感染日益增多，加强深部真菌感染的预防和监控，天津医科大学博士研究生学位论文进行深部真菌感染流行病学研究，深入探讨真菌耐药机制已刻不容缓。本研究以2002年度从天津市5家三级甲等医院分离的深部念珠菌临床株着手，分析其临床资料，探讨了对常见病原念珠菌快速、准确的临床基因诊断方法，对收集的白色念珠菌进行基因分型研究，为临床深部念珠菌感染的基因诊断、分子流行病学研究奠定基础。并初步探讨了耐氟康哇热带念珠菌临床株Fc30的耐药机制。第一部分天津地区深部念珠菌感染临床株分析目的:了解天津地区深部念珠菌感染的特点，分析深部念珠菌感染的危险因素及耐药特征，为合理使用抗生素提供依据。方法:从天津地区的5家大型医院收集2002年5月一11月的深部念珠菌感染临床分离株，应用WHOnets软件分析念珠菌临床分离株的特点，采用微量肉汤稀释法测定它们对多种抗真菌药物的敏感性。结果:2002从天津地区共分离深部感染念珠菌53株。白色念珠菌最多占47.17%，其次为热带念珠菌26.42%。深部念珠菌感染以肺部感染为主占69.81%:老年患者居多54.72%;患者均有基础疾病;抗生素、激素的大量使用、各种侵入性操作及免疫功能低下等是重要危险因素。念珠菌对酮康哇、5一氟胞啼咤敏感性高，无耐药;白色念珠菌、热带念珠菌对氟康哇敏感率分别为100%、92.9%，但光滑念珠菌、克柔念珠菌敏感率较低分别是62.5%、40%。四种念珠菌均对两性霉素B不同程度存在耐药，敏感率分别是白色念珠菌84%、热带念珠菌64.3%、光滑念珠菌75%、克柔念珠菌60%。结论:念珠菌是临床重要的条件致病菌，免疫力低下是深部念珠菌感染的重要原因，必须重视院内深部念珠菌感染的预防和监控。氟康哇仍是早期经验性治疗深部念珠菌感染及预防用药的最佳选择。天津医科大学博士研究生学位论文第二部分常见深部念珠菌感染的快速基因诊断、白色念珠菌基因分型及与耐药表型的关系目的:研究常见病原念珠菌快速、准确的基因诊断方法，为临床深部念珠菌感染的分子诊断奠定基础。建立白色念珠菌的基因分型方法，观察不同基因型药敏变化，为白色念珠菌分子流行病学研究奠定基础。方法:收集常见深部念珠菌感染临床株，应用多重PCR技术扩增念珠菌rDNA的内部转录间隔区ITSI一ITSZ，根据PCR产物片段的大小进行快速基因鉴定。采用PCR方法扩增白色念珠菌285 rDNA基因内含子区，以内含子大小及其中可转座I型内含子片段的缺失或插入作为分型依据。采用微量肉汤稀释法对不同基因型白色念珠菌进行药敏分析。结果:(1)53株常见院内感染念珠菌依据多重PCR电泳图谱分五型:热带念珠菌14株:单一条带，大小350饰。白色念珠菌25株:2条带，150bp和550bp。8株光滑念珠菌:单一条带，大小90Obp。克柔念珠菌5株:单一条带，大小550bp。乳酒念珠菌1株:单一条带，大小700bp。常见病原性细菌如:金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等经PCR扩增均无产物。快速多重引物PCR诊断结果与常规生化鉴定一致，检出率10既，无假阳性。(2)临床分离的25株白色念珠菌经PCR方法分为三型:A型12株(450bp)，B型10株(840bp)，C型3株(450bp、840bp)。A、B型为主要基因型，其药敏结果差异并不显著。结论:此多重PCR快速基因诊断方法简单、快速灵敏、特异性强、重复性好，有助于临床早期快速

全文目录

英文缩略语  3-4
中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
前言  12-19
第一部分天津地区深部念珠菌感染临床株分析  19-30
  材料与方法  20-22
  结果  22-26
  讨论  26-30
第二部分深部念珠菌感染快速基因诊断、白色念珠菌基因分型及与耐药表型的关系  30-50
  材料  32-33
  方法  33-38
  结果与分析  38-45
  讨论  45-50
第三部分氟康唑耐药热带念珠菌Fc30耐药机制的研究  50-71
  材料  52-54
  方法  54-60
  结果  60-68
  讨论  68-71
总结  71-73
参考文献  73-79
综述1  79-99
综述2  99-110
发表文章  110-111
致谢  111

深部念珠菌的基因诊断、分子分型及耐药机制研究

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