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基于凝胶电泳的蛋白质组研究策略及应用

作　者: 应万涛
导　师: 钱小红
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 二维电泳蛋白质组胎肝无血清培养基蛋白标志物
分类号: R341
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

人类基因组全序列测定的完成，标志着一个崭新的时代—后基因组时代的来临。生命科学从大规模的基因组序列分析转向对基因功能的研究，蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学的热点领域。开展大规模蛋白质组研究的必备条件是高分辨蛋白质分离技术和高通量、高灵敏度的鉴定技术。因此在本研究的第一部分首先优化了碱性蛋白质和超放大窄范围胶(Zoom gel)的二维电泳(2-DE)分离条件，并利用优化后的参数，建立高分辨胎肝全蛋白2-DE表达谱，分辨蛋白质点达到5487个。随后，探索了胶内蛋白质鉴定的策略，建立了基于2-DE的高通量胶上蛋白质点鉴定技术。同样，在本研究的第二部分优化了一维凝胶电泳和液相色谱串联质谱联合的复杂蛋白质混合物鉴定技术。利用上述建立的蛋白质组学研究技术体系，开展人胎肝蛋白质组表达谱研究。4-6月孕龄的人胎肝除具备正常肝生理功能外，还是胚内至关重要的造血器官，造血、免疫系统干祖细胞的主要来源。大规模的胎肝蛋白质组分析，将很有可能发掘与增殖、造血与发育相关的功能蛋白质。利用亚细胞蛋白质组技术、三种基于凝胶电泳的分离模式和多种质谱鉴定方法相结合，共计鉴定非冗余人胎肝蛋白质1045个，其中902个为功能已知的蛋白质，143个为首次从胎肝中发现的新蛋白。在此基础上，对已鉴定的蛋白质进行了系统地功能分类和相对丰度分析，并与9个其它相关蛋白质组表达谱数据进行了比较分析，获得了一批与正常肝、肝癌、造血和发育时期相关的蛋白质。肿瘤蛋白标志物的发掘是蛋白质组学的一个重要应用。在论文的第二部分，开展了肺癌细胞无血清培养分泌蛋白质组研究。共收集4对配对和一个肿瘤标本的无血清培养上清，全部采用SDS-PAGE和串联质谱鉴定，对配对样品进行差异蛋白质组分析，共鉴定非冗余分泌蛋白质238个。与已知血清蛋白库、全尿蛋白库进行同源比对分析表明，有153个蛋白质是首次从分泌蛋白体系中检出。9个用临床ELISA检测的蛋白质，无一例外地从人血清中检出，大部分蛋白质的差异表达模式与质谱结果相符，可用于指导进一步的临床肿瘤相关标志物筛选。总之，通过本研究，首先建立了大规模的人胎肝蛋白质组表达谱，就我们所知，这是目前国际上最为全面的人体器官蛋白质组表达谱。其次，本研究第一次提出了一种全新的肿瘤蛋白质组研究策略，可以有效富集低丰度分泌蛋白质，避开高丰度蛋白质的干扰，简化分析体系，实现潜在肿瘤蛋白标志物的高通量发掘。该体系将同样适用于其它肿瘤或重大疾病相关蛋白标志物的研究。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
缩略词对照表  7-8
前言  8-14
第一部分基于2-DE的蛋白质组表达谱研究策略及在人胎肝蛋白质组研究中的应用  14-52
  1 材料与方法  15-22
    1.1 试剂  15-16
    1.2 设备  16
    1.3 实验方法  16-21
      1.3.1 样品制备  16-17
      1.3.2 二维电泳分离  17-18
      1.3.3 图像分析  18
      1.3.4 蛋白质酶解  18-19
        1.3.4.1 自动切胶仪取点及酶解  18
        1.3.4.2 自动化胶点处理工作站取点及酶解  18-19
        1.3.4.3 一维电泳胶内酶解及提取  19
      1.3.5 质谱检测  19-21
        1.3.5.1 肽质量指纹谱  19-20
        1.3.5.2 串联MALDI-TOF-TOF质谱检测  20
        1.3.5.3 液相色谱四极杆串联质谱检测  20
        1.3.5.4 离子阱串联质谱检测  20-21
    1.4 大规模人胎肝蛋白质组数据库构建  21
    1.5 生物信息学分析  21
    1.6 胎肝蛋白质组数据库与相关蛋白质组数据库比较  21-22
  2 结果与讨论  22-48
    2.1 碱性区蛋白质二维电泳分离  22-23
    2.2 高分辨二维电泳分离胎肝全蛋白  23-26
    2.3 自动切胶仪取点及酶解策略  26-30
    2.4 基于自动化胶点处理工作站的高通量鉴定策略  30-31
    2.5 胎肝全蛋白质高通量鉴定  31-36
      2.5.1 2-DE-MS表达谱分析  31-34
      2.5.2 1-DE-MS／MS表达谱分析  34
      2.5.3 胎肝全蛋白表达谱构建  34-36
    2.6 胎肝亚细胞组分蛋白质组高通量鉴定  36
    2.7 大规模胎肝蛋白质组数据库构建  36-38
    2.8 与相关蛋白质组表达谱的比较分析  38-48
      2.8.1 与肝脏相关蛋白质组表达谱的比较分析  39-44
      2.8.2 与造血、胚胎发育相关蛋白质组表达谱的比较分析  44-48
  3 小结  48-49
  参考文献  49-52
第二部分基于1-DE的蛋白质组表达谱研究策略及在肿瘤蛋白质组研究中的应用  52-73
  1 材料与方法  54-57
    1.1 材料  54
    1.2 方法  54-57
      1.2.1 条件培养基的获取  54-55
      1.2.2 样品前处理  55
      1.2.3 SDS-PAGE分离  55
      1.2.4 胶内蛋白质酶  55-56
      1.2.5 肽混合物的质谱分析  56
      1.2.6 分泌蛋白质数据库构建  56-57
      1.2.7 分泌蛋白质的血清学检验  57
  2 结果与讨论  57-69
    2.1 无血清培养基分泌蛋白质的分离  57
    2.2 SDS-PAGE胶内蛋白质的酶解与提取  57-58
    2.3 SDS-PAGE胶内蛋白质的鉴定  58
    2.4 分泌蛋白数据库构建  58-64
    2.5 差异表达分泌蛋白质功能初探  64-67
    2.6 分泌蛋白质的临床验证  67-69
  3 小结  69-70
  参考文献  70-73
结论  73-74
附录  74-110
  附表1-1  74-103
  附表2-1  103-110
文献综述  110-119
文章、专著与会议  119-124
致谢  124

基于凝胶电泳的蛋白质组研究策略及应用

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