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一种用于转基因植物安全性控制的高效基因删除系统“Gene-Deletor”的构建

作　者: 罗克明
导　师: 裴炎；李义
学　校: 西南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 转基因植物生物安全性 FLP/FRT 融合识别位点loxPFHT 基因删除系统 Gene-Deletor Lat52启动子 Bgp启动子 pAB5启动子 Cre/loxP 热激蛋白启动子Hsp18.2 杂交
分类号: S336
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 774次
引　用: 7次
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内容摘要

人类一直致力于通过传统遗传育种的方法来提高作物产量和改善作物品质。但经过几千年的不断挖掘和利用，到了二十一世纪的今天，仅仅依靠传统遗传育种来达到改良作物的目的已经变得越来越困难。植物转基因技术的出现给人类解决粮食问题带来了新的希望。经过20多年的发展，植物转基因技术日臻成熟，转基因作物的种植面积迅速增加，其经济效益日渐显著。但自转基因技术诞生以来，科学界和社会公众对转基因植物生物安全性的担忧就一直存在，对转基因技术是否安全的争论从未停止。因此，如何通过生物技术等手段，解决转基因植物中的安全隐患，消除公众对转基因植物安全性的担心，已成为转基因植物推广和应用中必须解决的关键问题。目前，人们对转基因植物生物安全性的考虑主要集中在：①外源基因可能对生态环境和生物多样性带来不利的影响。例如，转基因植物花粉或种子的扩散造成基因逃逸(Gene flow)，外源基因可能转移到杂草或近缘物种中，产生“超级杂草”；外源基因(如Bt基因)可能对非靶标生物构成潜在威胁等，这些都可能给生态平衡和生物多样性造成灾难性的后果。②转基因食品对人类健康的潜在危害。如一些杀虫、抗菌基因和过敏蛋白可能危害人类健康，以及抗生素抗性基因逃逸到人类病原微生物中，造成潜在危险等。转基因植物巨大的经济价值和潜在的风险，使我们不得不考虑建立相应的技术体系，来解决转基因植物应用中的安全性问题，即如何在享受转基因技术带来福祉的同时，最大限度地消除其潜在的危险。为此，转座子(transposon)技术、共转化(co-transformation)技术和位点特异性重组酶(site-specific reombinase)技术等，已相继应用于转基因植物安全性的控制中。但是，目前这些技术主要是用于删除转基因植物中的抗性标记基因，并不能去除包括目的基因(如Bt基因)在内的所有外源基因，这些基因的存在同样可能带来转基因安全性问题。而且，已报道的这些系统，均存在删除外源基因的效率低、删除外源基因的周期长等缺点，远不能满足田间大规模种植的转基因作物安全性控制的需要。相对而言，在这些摘要技术中，位点特异性重组酶技术在转基因植物中研究较多、应用最为广泛，但现有重组酶系统删除效率最高也只能达到80%左右，同样不能删除所有外源基因，致使该系统难以应用于生产中解决转基因植物的安全性问题。为了获得高效的基因删除系统，彻底删除转基因植物中所有的外源基因，解决转基因植物可能带来的生物安全性问题，本论文针对现有重组酶系统存在的不足，对影响删除效率的两个关键因素:重组酶的特异性识别位点和重组酶基因的表达进行了研究，构建了具有融合识别位点的高效基因自动删除系统。在转基因烟草的花粉和种子中，所有外源基因都被100%地删除，首次实现了在转基因植物中获得非转基因的花粉和种子，为解决由于转基因植物花粉或种子扩散引起基因逃逸的问题，提供了一个可行的技术手段。该系统命名为“Gene一Deletor”。论文主要研究结果如下:1.识别位点对位点特异性重组酶系统删除效率的影响在位点特异性重组酶系统Cre/I oxP和FLP/F天T中，识别位点2以尸和FRT是影响系统删除效率的关键元件之一。为了弄清识别位点对删除效率的影响，分别比较了含有单识别位点FRT和融合识别位点IOxPFRT的重组酶系统在转基因植物中的删除效率。为此，构建了四个表达载体，分别为:具有单识别位点尸尺T的载体①pFBFGN(重组酶基因FLP由花粉特异性启动子BgP启动)和载体②pFLCGN (重组酶基因Cre由花粉特异性启动子Lat52启动);具有融合识别位点IOxP万天T的载体③pLFBFGN和载体④pLFLcGN，重组酶基因FLP和cre的表达同样采用上述启动子控制。将各个载体分别转化烟草，分析了在转基因植物花粉基因组中外源基因的删除效率。结果发现，在含单识别位点FRT的重组酶系统中，具有重组酶Cre基因的pFLCGN系统和具有重组酶基因FLP的pFBFGN系统，最高删除效率分别为34.3%和”.5%;而在含有7OxPF火T融合识别位点的重组酶系统中，无论是带有Cre基因的pLFLCGN系统，还是具有FLP基因的pLFBFGN系统，其最高删除效率均达到100%。表明融合识别位点(loxPF天T)可以显著地提高位点特异性重组酶系统在转基因植物中的删除效率。西南农业大学博士论文2.启动子对位点特异性重组酶系统删除效率的影响在位点特异性重组酶系统中，重组酶基因的表达(表达水平、表达时间及表达组织特异性)是影响系统删除效率的另一个关键因素。论文选取①组成型启动子(CaMv 355)，②组织特异性启动子(花粉特异性启动子BgP和花粉、子房以及早期胚胎特异性表达启动子pABS)，③诱导性启动子(热激蛋白启动子HsP 18.2)，分别控制重组酶FLP基因的表达，比较了在不同类型启动子引导下，重组酶FLP基因表达对均含有融合识别位点系统删除效率的影响。结果表明:①在组成型启动子CaMV 355启动重组酶FLP基因表达的转基因烟草中，其最高删除效率只能达到66.8%。与野生型植株相比，转基因植株的生长受到抑制，叶片出现畸形?

全文目录

中文摘要  12-19
英文摘要  19-26
第一部分文献综述  26-56
  1.1 转基因植物的发展现状  27-32
    1.1.1 世界转基因植物发展概况  27-29
    1.1.2 我国转基因植物发展现况  29-32
  1.2 转基因植物的生物安全性问题  32-56
    1.2.1 转基因植物生态环境的安全性问题  34-42
      1.2.1.1 转基因植物杂草化问题  34-35
      1.2.1.2 转基因逃逸及其对近缘物种潜在的影响  35-37
      1.2.1.3 转基因植物中外源基因对非靶标生物的危害  37-39
      1.2.1.4 转基因植物对生物多样性的影响  39-40
      1.2.1.5 转基因植物中抗病毒外源基因潜在的生态风险  40-42
    1.2.2 转基因食品的安全性问题  42-44
      1.2.2.1 转基因食品可能对人类造成的直接危害  42-43
      1.2.2.2 转基因食品的过敏问题  43
      1.2.2.3 转基因植物中抗生素标记基因产生的影响  43-44
    1.3 目前解决转基因植物安全性问题的手段  44-56
      1.3.1 防止转基因植物中外源基因逃逸的手段  44-47
        1.3.1.1 花粉不育技术  44-45
        1.3.1.2 种子不育或无籽的生物技术  45-46
        1.3.1.3 叶绿体转基因技术  46-47
      1.3.2 转基因植物中外源基因的删除技术  47-56
        1.3.2.1 共转化技术  48-49
        1.3.2.2 转座子技术  49-50
        1.3.2.3 位点特异性重组酶技术  50-56
第二部分引言  56-60
  2.1 本论文的立论依据  56-58
  2.2 实验设计和技术路线  58-60
第三部分高效基因删除系统“Gene-Deletor”的建立  60-148
  第一章位点特异性重组酶系统中识别位点对删除效率的影响  60-104
    摘要  12-16
    关键词  16-61
    前言  61-62
    1.1 材料  62-65
      1.1.1 植物材料  62
      1.1.2 菌株和质粒  62
      1.1.3 主要化学试剂  62
      1.1.4 主要仪器设备  62-63
      1.1.5 主要缓冲液配方  63-64
      1.1.6 主要培养基配方  64-65
    1.2 方法  65-75
      1.2.1 载体构建  65-70
        1.2.1.1 引物设计及序列合成  65-68
        1.2.1.2 PCR扩增反应的条件  68-69
        1.2.1.3 大肠杆菌质粒DNA的提取  69-70
        1.2.1.4 琼脂糖凝胶上DNA片段的回收  70
        1.2.1.5 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备和DNA连接产物的转化  70
      1.2.2 根癌农杆菌LAB4404感受态细胞的制备、转化和质粒DNA的提取  70-72
        1.2.2.1 根癌农杆菌感受态的制备及转化  70-71
        1.2.2.2 根癌农杆菌质粒DNA的提取  71-72
      1.2.3 烟草的遗传转化  72
      1.2.4 烟草基因组DNA的提取  72-73
      1.2.5 转基因植物GUS组织染色  73
      1.2.6 转基因植物的Km抗性筛选  73
      1.2.7 转基因植物与野生型的杂交  73
      1.2.8 Southern杂交  73-75
        1.2.8.1 探针制备  73-74
        1.2.8.2 Sephadex G-50层析柱的制备  74
        1.2.8.3 基因组DNA的制备、酶切和电泳  74
        1.2.8.4 转膜  74
        1.2.8.5 杂交和洗膜  74-75
        1.2.8.6 放射自显影  75
    1.3 结果与分析  75-100
      1.3.1 载体构建  75-82
        1.3.1.1 人工合成片段的克隆及序列分析  75-76
        1.3.1.2 花粉特异性启动子Lat52和Bgp的克隆及序列分析  76-78
        1.3.1.3 GUS和NPTⅡ融合基因的构建  78
        1.3.1.4 载体pFBFGN、pFLCGN、pLFBFGN和pLFLCGN的获得  78-82
      1.3.2 烟草遗传转化的结果  82
      1.3.3 转基因烟草的鉴定  82-87
        1.3.3.1 GUS组织染色的初步鉴定  82-83
        1.3.3.2 转基因烟草的PCR检测  83-84
        1.3.3.3 Southern杂交检测  84-85
        1.3.3.4 转基因植株中外源基因拷贝数的确定  85-87
      1.3.4 转基因植株不同时期花粉的GUS组织染色结果  87-88
      1.3.5 转基因植株不同时期花粉的显微观察  88-90
      1.3.6 转基因植株与野生型杂交后代GUS组织染色结果的观察  90-93
      1.3.7 含不同识别位点特异性重组酶系统删除效率的统计及比较  93-95
      1.3.8 转基因pLFBFGN植物花粉中外源基因的Southern杂交检测  95-96
      1.3.9 转基因植物花粉基因组中残余外源片段的PCR检测  96-98
      1.3.10 转基因植物杂交后代中T-DNA残余片段的序列分析  98-100
    1.4 讨论  100-104
  第二章位点特异性重组酶系统中启动子对删除效率的影响  104-136
    摘要  12-16
    关键词  16-105
    前言  105-106
    2.1 材料  106-107
      2.1.1 植物材料  106-107
        2.1.2 菌株  106
        2.1.3 主要化学试剂  106
        2.1.4 主要仪器设备  106
        2.1.5 主要缓沖液配方  106-107
        2.1.6 主要培养基配方  107
    2.2 方法  107-110
      2.2.1 载体构建  107-108
        2.2.1.1 引物的设计及合成  107-108
        2.2.1.2 PCR的扩增条件  108
      2.2.2 烟草的遗传转化  108
      2.2.3 烟草总RNA的提取  108-109
      2.2.4 RT-PCR扩增  109
      2.2.5 转基因植物的二次转化  109
      2.2.6 转基因烟草的热激处理  109-110
      2.2.7 转基因植物GUS组织染色  110
      2.2.8 转基因植物中GUS蛋白含量的测定  110
    2.3 结果与分析  110-132
      2.3.1 不同启动子序列的获得  110-114
        2.3.1.1 Hsp18.2启动子的克隆及序列分析  110-112
        2.3.1.2 pAB5启动子的克隆及序列分析  112-114
        2.3.1.3 CaMV 35S启动子的获得  114
      2.3.2 载体构建  114-118
        2.3.2.1 载体p35S-Flp的构建  114-116
        2.3.2.2 载体pLFBFGN的获得  116
        2.3.2.3 载体pLFHFGN和pLFABFGN的构建  116
        2.3.2.4 所有表达载体的示意图  116-118
      2.3.3 转基因烟草的获得  118
      2.3.4 转基因烟草的检测  118-120
        2.3.4.1 转基因植物的GUS组织染色检测  118
        2.3.4.2 转基因植物的PCR检测  118-120
      2.3.5 不同转基因烟草形态观察及比较  120-121
      2.3.6 转基因pLFBFGN植物中不同组织的GUS染色结果  121-122
      2.3.7 RT-PCR检测转基因pLFBFGN植物中FLP基因的表达水平  122-124
      2.3.8 p35S-FLP转化转基因pLFGN植物后的GUS染色定量分析  124-125
      2.3.9 转基因pLFABFGN植物中不同组织的GUS染色结果  125-126
      2.3.10 转基因pLFABFGN植物自交和杂交后代GUS染色结果观察  126-128
      2.3.11 转基因pLFABFGN植物删除效率的统计  128-129
      2.3.12 转基因pLFHFGN植物热激处理后的GUS染色结果  129-130
      2.3.13 转基因pLFHFGN植物热激处理后的删除效率分析  130-132
    2.4 讨论  132-136
  第三章位点特异性重组酶系统中重组酶对删除效率的影响  136-148
    摘要  12-16
    关键词  16-137
    前言  137-138
    3.1 材料  138
      3.1.1 植物及菌株  138
      3.1.2 主要化学试剂、培养基和缓冲液配方  138
    3.2 方法  138
      3.2.1 载体构建  138
      3.2.2 烟草的遗传转化  138
      3.2.3 转基因植物GUS组织染色  138
      3.2.4 转基因植物的PCR检测  138
      3.2.5 转基因植物的杂交  138
    3.3 结果与分析  138-145
      3.3.1 载体的构建  138-140
        3.3.1.1 pLFBFGN和pLFBFGN载体的构建  138-139
        3.3.1.2 载体pLFCFGN的获得  139-140
        3.3.1.3 表达载体的示意图  140
      3.3.2 转基因烟草的检测  140-141
      3.3.3 转基因植株不同组织的GUS染色结果  141
      3.3.4 转基因植株中外源基因拷贝数的确定  141-143
      3.3.5 转基因pLFCFGN植物的删除效率统计结果  143-145
      3.3.6 重组酶对系统删除效率的影响  145
    3.4 讨论  145-148
第三部分内容总结:高效基因删除系统'Gene-Deletor”的获得  148-150
第四部分杂交途径的基因删除系统  150-164
  摘要  12-16
  关键词  16-151
  前言  151-152
  4.1 材料  152
    4.1.1 植物材料和菌株  152
    4.1.2 主要化学试剂、培养基和缓冲液配方  152
  4.2 方法  152-154
    4.2.1 PCR扩增及序列分析  152
    4.2.2 载体构建  152
    4.2.3 烟草的遗传转化  152-153
    4.2.4 转基因植物的GUS组织染色  153
    4.2.5 转基因植物的PCR检测  153
    4.2.6 转基因植株中外源基因拷贝数的确定  153
    4.2.7 转基因植物纯合体的获得  153-154
    4.2.8 转基因植物的杂交  154
  4.3 结果与分析  154-161
    4.3.1 启动子Agl5的克隆及序列分析  154-156
    4.3.2 载体的构建  156-157
      4.3.2.1 载体pLFGN的构建  156
      4.3.2.2 载体pAgl-Cre的获得  156-157
    4.3.3 转基因烟草的PCR检测  157-158
    4.3.4 转基因烟草单拷贝植株的获得  158-160
    4.3.5 转基因单拷贝植株纯合体的获得  160
    4.3.6 转基因植物单拷贝纯合体杂交后代中删除效率的统计  160-161
  4.4 讨论  161-164
第五部分主要结论及创新点  164-168
参考文献  168-186
附录1 英文缩写  186-188
附录2 常用缓冲液配方  188-189
附录3 学习期间参加的科研项目  189-190
附录4 发表和撰写的论文  190-192
致谢  192-194

一种用于转基因植物安全性控制的高效基因删除系统“Gene-Deletor”的构建

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