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烟草种间胞质杂种、对称体细胞杂种的获得及其分子标记鉴定

作　者: 孙玉合
导　师: 薛庆中
学　校: 浙江大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 烟草 体细胞杂交 胞质杂种 对称杂种 Rhodamine 6G 新胞质雄性不育系 RAPD SCAR AY437884 AY437885 农艺性状 抗病性
分类号: S572
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


本论文的研究内容包括三个方面：应用种间体细胞杂交技术结合Rhodamine 6G处理，快速创造含有N．repanda细胞质的烟草新胞质雄性不育系；对普通烟草（Nicotiana tabacum）与粉蓝烟草（N．glauca）种间对称体细胞杂种进行形态学、细胞学和分子标记分析，以及烟草种间体细胞杂种的高世代材料主要农艺性状观察分析和抗病性鉴定。主要结论如下： 1．Rhodamine 6G是细胞线粒体中葡萄糖的氧化磷酸化的专性抑制剂。5 μg／mlRhodamine 6G处理普通烟草（N．tabacum）K326的叶片原生质体15 min，可以钝化烟草原生质体停止分裂。 2．K326原生质体经Rhodamine 6G处理后与未经钝化的野生烟草N．repanda原生质体在PEG、高Ca2+、高pH溶液的诱导作用下融合、培养，获得了33株再生植株。均为雄性不育，用普通烟草花粉授粉可正常结实。 3．再生植株形态与亲本普通烟草相仿，株间形态差异较小；过氧化物同功酶和脂酶同功酶带型分析，再生植株与普通烟草亲本一致，未发现野生烟草的特异条带。再生植株具有48条染色体。采用32个随机引物对进行RAPD分析，再生植株与普通烟草呈高度一致性，未发现N．repanda特异的条带。采用N．repanda特异性的线粒体F1-ATP synthase subunit alpha（atpA）基因片段为引物分析，发现再生植株线粒体DNA样品含有该特异长度片段。证实再生植株是种间胞质杂种，它具有普通烟草细胞核并含有野生烟草N．repanda细胞质线粒体基因组成分。 4．用K326及其他普通烟草的栽培品种与胞质杂种回交，杂种后代植株形态表现整齐一致，未出现分离，不育性保持稳定。新胞质雄性不育系的农艺性状较好，抗病性较高，烟叶化学成分适中，野生烟草细胞质的负面效应不明显。 5．通过N．tabacum（2n=48）革新一号和粉蓝烟草N．glauca（2n=24）原生质体融合获得了一个种间对称的体细胞杂种。该对称杂种具有72条染色体，形态上有别于亲本及烟草属内其他种，正常花粉率为32％，自交可结实，后代性状保持稳定。 6．采用RAPD标记技术对烟草种间对称体细胞杂种进行鉴定，结果证实杂种含有双亲的特异片段，但仅6个随机引物产生的带型表现为双亲的组合型。 7．将引物S18产生的RAPD多态性片段进行克隆，测序，获得了两条序列被GenBank收录（登记号分别为AY437884和AY437885）。根据测序结果，重新设计20 bp引物分析对称体细胞杂种基因组DNA，将RAPD标记转换为SCAR标记。8.对8个烟草体细胞杂交高世代材料进行田间农艺性状观察、统计分析和黑胫病抗性鉴定，以探讨他们在育种上的利用价值。结果显示，体细胞杂种经过多次回交改良，性状逐步稳定，抗病性有所提高，化学成分也基本协调。其中三个品系各项农艺学性状优良。拟参加品种比较试验，并进行化学成分分析和评吸鉴定。

全文目录


中文摘要  11-13
英文摘要  13-15
第一章 植物体细胞杂交研究现状  15-56
  1．1 植物体细胞杂交的意义  15
  1．2 植物原生质体融合技术  15-17
    1．2．1 离子诱导融合技术  16
    1．2．2 聚乙二醇（PEG）法  16-17
    1．2．3 电融合  17
  1．3 植物体细胞杂交方式  17-20
    1．3．1 对称融合与不对称体细胞融合  17-19
    1．3．2 配子—体细胞杂交  19-20
  1．4 植物体细胞杂种的细胞学研究（融合体的发育）  20-22
    1．4．1 异核体的核融合和染色体行为  20-21
    1．4．2 亲缘关系对融合体发育的影响  21-22
  1．5 植物体细胞杂种细胞的筛选技术的研究  22-25
    1．5．1 利用对外源激素的要求不同进行选择  22
    1．5．2 利用生长习性和愈伤组织颜色不同进行选择  22-23
    1．5．3 利用突变细胞系互补进行选择  23-24
    1．5．4 根据原生质体形态机械分离杂种原生质体  24-25
    1．5．5 外源抗性标记基因的应用  25
    1．5．6 钝化系统的应用  25
  1．6 植物体细胞杂种的鉴定技术研究  25-31
    1．6．1 形态学观察  25-26
    1．6．2 染色体数目和核型的检查  26
    1．6．3 生物化学检测  26-27
    1．6．4 DNA分子标记鉴定  27-31
  1．7 植物体细胞杂种的类型及其细胞学特征  31-34
    1．7．1 对称杂种（symmetric somatic hybrids）  31-32
    1．7．2 不对称杂种（asymmetric somatic hybrids）  32-33
    1．7．3 胞质杂种（cytoplasmic hybrid，cybrid）  33-34
  1．8 植物体细胞杂种细胞质基因组的遗传  34-37
    1．8．1 叶绿体基因组的遗传  34-36
    1．8．2 线粒体基因组的遗传  36-37
  1．9 植物体细胞杂种后代性状遗传特点与改良利用  37-40
    1．9．1 植物体细胞杂种后代性状遗传特征  37-39
    1．9．2 植物体细胞杂种的改良利用  39-40
  1．10 烟草种间体细胞杂交研究及应用现状  40-46
    1．10．1 已获得的烟草体细胞杂种  41-42
    1．10．2 烟草种间体细胞杂种的改良和利用  42-44
      1．10．2．1 抗病性转移  43
      1．10．2．2 抗虫性转移  43-44
      1．10．2．3 高尼古丁含量的转移  44
      1．10．2．4 烟草新胞质雄性不育系的创造  44
    1．10．3 烟草种间体细胞杂交存在的问题  44-46
  参考文献  46-56
第二章 应用种间体细胞杂交快速创造烟草胞质雄性不育系  56-80
  2．1 材料与方法  58-65
    2．1．1 材料  58
    2．1．2 烟草叶片原生质体的制备  58
    2．1．3 Rhodamine 6G钝化处理  58-59
    2．1．4 诱导融合及培养  59
    2．1．5 再生植株形态学观察  59
    2．1．6 染色体数目检测  59-60
    2．1．7 同功酶检测  60-62
      2．1．7．1 脂酶同工酶分析  60-62
      2．1．7．2 过氧化物同工酶分析  62
    2．1．8 基因组DNA的RAPD分析  62-64
      2．1．8．1 烟草叶片基因组DNA的提取  62-63
      2．1．8．2 随机引物扩增的反应条件及电泳  63-64
    2．1．9 线粒体atpA基因特异片段的PCR扩增和检测  64-65
      2．1．9．1 烟草线粒体DNA的提取  64-65
      2．1．9．2 PCR扩增  65
    2．1．10 回交与配制F_1杂交一代  65
    2．1．11 抗病性鉴定  65
  2．2 结果与分析  65-75
    2．2．1 烟草叶片原生质体的分离  65-66
    2．2．2 Rhodamine 6G处理对烟草原生质体活性的影响  66-67
    2．2．3 原生质体融合与培养  67
    2．2．4 再生植株的生物学特征  67-70
      2．2．4．1 再生植株形态  67-69
      2．2．4．2 再生植株的育性  69-70
    2．2．5 再生植株体细胞染色体数目  70
    2．2．6 再生植株脂酶同工酶和过氧化物同功酶检测  70
    2．2．7 RAPD多态性检测结果  70-73
    2．2．8 线粒体基因组atpA基因的分析  73
    2．2．9 回交F_1代及杂交F_1代的田间表现  73
    2．2．10 抗病性  73-75
  2．3 结论与讨论  75-78
    2．3．1 Rhodamine 6G对烟草原生质体的钝化作用  75-76
    2．3．2 胞质杂种的获得  76-77
    2．3．3 新胞质雄性不育系的意义  77-78
  参考文献  78-80
第三章 普通烟草（N．TABACUM）与粉蓝烟草（N．GLAUCA）种间对称体细胞杂种的形态学、细胞学和分子标记技术分析  80-100
  3．1 材料与方法  80-85
    3．1．1 植物材料  80-81
    3．1．2 原生质体分离纯化，融合与植株再生  81
    3．1．3 体细胞染色体数目分析  81
    3．1．4 核基因组DNA分析（RAPD and SCAR）  81-85
      3．1．4．1 烟叶样品DNA提取  81
      3．1．4．2 随计引物扩增的PCR反应及电泳  81-82
      3．1．4．3 扩增产物的纯化  82
      3．1．4．4 多态性扩增产物克隆  82-83
      3．1．4．5 大肠杆菌DH5 α感受态细胞制备和转化  83-84
      3．1．4．6 大肠杆菌质粒DNA的提取  84-85
      3．1．4．7 克隆片段的测序  85
    3．1．5 特异引物的设计及PCR反应  85
  3．2 结果与分析  85-94
    3．2．1 原生质体培养与体细胞杂种植株的再生  85-86
    3．2．2 对称体细胞杂种的形态学和育性表现  86
    3．2．3 杂种的体细胞染色体数目及其核基因组成分分析  86-94
  3．3 讨论  94-97
  参考文献  97-100
第四章 烟草种间体细胞杂种高世代材料主要农艺性状观察分析和抗病性鉴定  100-111
  4．1 材料与方法  101-103
    4．1．1 烟草体细胞杂种高世代材料及其来源。  101
    4．1．2 田间实验设计  101
    4．1．3 田间管理  101-102
    4．1．4 抗病性试验  102-103
  4．2 结果与分析  103-106
    4．2．1 主要生物学性状调查  103
    4．2．2 主要农艺性状分析  103-106
      4．2．2．1 亩产量  103-104
      4．2．2．2 亩产值  104-105
      4．2．2．3 均价  105
      4．2．2．4 级指  105-106
    4．2．3 抗病性鉴定  106
  4．3 讨论  106-109
  参考文献  109-111
附录A SHANGHAI SHANGON随机引物序列  111-112
附录B 表目录  112-113
附录C 图目录  113

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 烟草（菸草）
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