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转基因抗虫棉Bt基因的遗传效应与定位研究

作　者: 左开井
导　师: 孙济中；张启发
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花(Gossypium hirsutum L) 转基因 Bt 抗虫遗传效应
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

转基因抗虫棉是随着DNA重组技术的深入发展，常规抗虫育种难以选育出高抗虫品种，以及化学防治易使害虫产生抗药性、造成环境污染的情况下产生的。转基因抗虫品种在生产上的广泛利用是解决这些问题的一种有效途径。然而，人们在转基因抗虫棉的生产和研究过程中发现，害虫由于承受高选择压力容易产生对杀虫蛋白的抗性，此外，转基因抗虫品种（系）对农艺性状的影响也有诸多报道。如何解决害虫的耐性问题以及转基因抗虫棉抗虫性与丰产性的协调关系问题就具有普遍的现实意义。本文通过田间试验、抗性鉴定、转基因抗虫品种（系）与原始受体品种之间的遗传差异分析等手段对不同来源的转基因抗虫品种（系）Bt基因的遗传效应、抗虫性与丰产性相互关系等进行了系统研究，获得的主要结果如下。 1．对不同来源的转基因抗虫品种和推广品种鄂荆1号，鄂抗3号植株的不同组织进行抗虫性鉴定，转基因抗虫品种均表现高抗虫性，不同组织的抗虫性有所差异，依次为叶＞苞叶＞蕾＞花。 2．利用284份探针对泗3Bt和原始受体品种泗棉3号之间进行RFLP分析，发现了PAR4-34，PGH639，PGH663，PXP2-75，PAR931等5个多态性位点。该5个位点分别分布于不同的染色体或连锁群中。161R和161S与泗棉3号之间的多态性位点为A1485和PAR355。从上述结果可以看出Bt插入到泗棉3号以后，基因组并没有检测到大范围的重排。 3．对一套4×3半双列杂交组合以及2对近等基因系组合的遗传分析和抗虫性鉴定发现，杂交组合在没有Bt基因存在的情况下，Bt基因的引入对于杂交组合的抗虫性增强和产量增加有显著作用。杂交组合在有Bt基因存在的情况下，基因的拷贝数增加对杂交组合之间的抗虫性差异不具有显著影响，组合之间的产量没有显著变化，Bt基因不具有基因剂量效应。 4．对6个F₂群体的单株抗虫性与其20个不同的农艺性状的遗传相关分析发现，6个群体中抗虫性与烂铃率相关均达到显著水平，系数为-0.2000以上，抗虫性的最直接表现为烂铃数减少。此外，6个群体中抗虫陸与衣分的相关系数均为负值但未达到显著水平，说明抗虫性与衣分有一定的负向作用但不明显。在6个群体中其他18个性状与抗虫性的关系表现并不一致。对5个F₂群体单株的中亲优势与抗虫性相关分析发现，5个群体中单株抗虫性与烂铃率的中亲优势相关均达到显著水平，系数最低为-0.2830，最高为-0.7650。抗虫性与铃数的中亲优势相关性在群体间有所不同，3个群体中单株抗虫性与铃数为负向相关关系，其它2个群体中则为正向关系，但均未达到显著水平。上述结果表明抗虫性对产量性状不具有显著的负向影响。 5．对3个不同来源转基因抗虫品种（系）进行了遗传分析和等位性测验，3个转基因抗虫品种（系）中的Bt基因抗感分离比例相同。泗3Bt、美国抗虫棉与不同的推广品种杂交F₂代群体中抗感分离比例为3：1，符合1对基因分离规律。对转基因品系泗3Bt分析发现其整合有2个Bt基因拷贝，完整的基因拷贝为1个。不同的转基因抗虫品种（系）的Bt基因插入位置并不相同。 6.对5个不同来源转基因挽卿感虫品种（系）Bt基因的插入区域进行结构分析发现，Bt基因的上游携带有质粒载体片段。5个不同转基因材料中Bt基因的下游均为富含AT重复序列。由泅棉3号为原始受体品种得到的3个转基因品系Bt基因的下游有较高的同源性，其中由同一转化单株分离抗虫和感虫品系1 6lR和1615的相同片段达到181如，说明它们的来源相同。由于Bt基因本身为富含AT序列结构的基因，这种重复序列的存在对于基因的整合和稳定表达可育步痛一定作用。 7.利用284份RFLP技跨1‘，1对k吹，SSR引物，5对SSR引物和14个RAPD引物对s3Bt x Ejing.l杂交得到的瓦分离群体152个单株进行分析，构建1张总长度为1275.5cM，覆盖棉花基因组总长度的25.5%左右的棉花分子摘蕊己连锁图谱。这是国内在棉花上较早采用多种分子标记构建遗传连锁图谱。利用该分子标记连锁图谱和20个农艺性状的结果，将分别控布卿数、铃重、衣分、纤维长度等性状的12个QTL位点定位在不同的连锁群上。找到2个与Bt基因交卿巨离为3 8.3cM和40.翻M分子栩己。最后，基于对本研究的一些结果和对抗虫育种及相关研究的理解，提出了解决昆虫耐性的一些策略，’同时刘棉花图谱的构建和运用于相关研究和生产提出了自己的一些见解。

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中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1 前言  12-28
  1.1 棉花分子生物学研究现状  12-19
    1.1.1 棉花的基因组研究和基因定位  12-15
    1.1.2 棉花的起源与进化研究  15-17
    1.1.3 棉花的纤维发育分子生物学  17-19
  1.2 棉花的抗虫研究  19-26
    1.2.1 转基因抗虫棉的来源与种类  20-21
    1.2.2 抗虫基因的转化和鉴定方法  21-22
    1.2.3 转基因抗虫棉的育成途径  22
    1.2.4 转基因抗虫棉的抗生、产量及农艺性状表现  22-23
    1.2.5 转基因抗虫棉推广中的问题  23-26
  1.3 研究的目的和意义  26-27
  1.4 研究的主要内容  27-28
2 材料与方法  28-37
  2.1 试验材料  28-30
    2.1.1 供试棉种  28-29
    2.1.2 基因来源及结构  29
    2.1.3 半双列杂交组合配制  29
    2.1.4 定位群体和等位测验群体的构建  29-30
  2.2 抗虫鉴定  30
  2.3 农艺性状的考察  30-31
    2.3.1 F_2分离群体的田间种植和农艺性状考察  30
    2.3.2 半双列杂交组合的农艺性状的考察  30-31
  2.4 RFLP分析  31-34
    2.4.1 棉花基因组DNA的提取  31
    2.4.2 RFLP分析  31-33
    2.4.3 质粒DNA的抽提  33-34
    2.4.4 芽孢杆菌质粒DNA的抽提  34
  2.5 DNA插入区间的结构分析  34-36
    2.5.1 热不对称PCR的扩增  34-35
    2.5.2 反向PCR的扩增  35
    2.5.3 PCR产物的回收与克隆  35-36
    2.5.4 DNA测序与比较分析  36
  2.6 分子标记连锁图谱的构建  36
  2.7 统计方法  36-37
3 转基因抗虫棉抗虫性表现与Bt基因的遗传效应分析  37-59
  3.1 不同来源转基因抗虫棉的抗虫性  37-40
  3.2 不同来源抗虫棉的田间性状表现  40
  3.3 泗3Bt与原始受体品种之间的遗传差异分析  40-41
  3.4 抗虫棉与推广品种间配合力分析  41-44
  3.5 六个分离群体中产量与抗虫性的相互关系  44-45
  3.6 讨论  45-59
4 转基因抗虫棉的Bt基因遗传分离规律和插入区结构分析  59-70
  4.1 引言  59
  4.2 结果与分析  59-67
    4.2.1 转基因抗虫棉的Bt插入鉴定  59-60
    4.2.2 转基因抗虫棉Bt插入拷贝数分析  60-61
    4.2.3 不同来源的抗虫棉的Bt在F_2代的分离规律与等位性测验  61
    4.2.4 抗虫棉Bt基因插入区间的DNA结构分析  61-67
      4.2.4.1 Bt插入区间的DNA结构分析策略  61-62
      4.2.4.2 Bt基因插入区间的下游DNA结构分析  62-65
      4.2.4.3 Bt插入区小游的上游DNA结构分析  65-67
  4.3 讨论  67-70
5 棉花分子标记连锁图谱的构建与QTL定位  70-77
  5.1 引言  70
  5.2 结果与分析  70-72
    5.2.1 多态性筛选  70-71
      5.2.1.1 RFLP探针多态性筛选  70
      5.2.1.2 RAPD引物的多态性筛选  70
      5.2.1.3 SSR引物的多态性筛选  70-71
      5.2.1.4 Inter-SSR和SSR引物的多态性筛选  71
    5.2.2 RFLP图谱的构建  71-72
    5.2.3 QTL位点的定位  72
  5.3 讨论  72-77
6 参考文献  77-89
7 附录  89-93
8 致谢  93

转基因抗虫棉Bt基因的遗传效应与定位研究

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