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新型酶联荧光、电化学免疫及DNA传感技术的研究

作　者: 龚福春
导　师: 俞汝勤；沈国励
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 酶联荧光免疫传感布氏杆菌日本血吸虫新城疫 8-羟基喹啉镁络合物 4-氨基安替比林酶反应扰动电化学DNA传感器中性红
分类号: O657.1
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

免疫传感技术在临床诊断、食品和药物分析以及环境化学等领域具有广阔应用前景，因而吸引了众多研究者的兴趣。免疫组分的特异性反应完全可以保证免疫传感器极高的选择性，提高其检测灵敏度、重复使用性和使用寿命成为了免疫传感器研究的重点和热点。酶联荧光免疫传感技术是藕合高灵敏度的荧光检测与酶联化学倍增放大作用的一种新型免疫传感分析技术，该技术为极大地提高免疫分析的灵敏度提供了可能性。制备酶联荧光免疫传感器或装置的支撑技术有两方面：其一是免疫组分的固定及生物组分支撑体表面的再生；其二是酶荧光底物的开发。在这项技术中，目前主要有免疫组分支撑体表面的再生、免疫组分活性保持和新型荧光底物开发的问题亟待解决；与其它免疫传感器相比，电化学免疫传感器具有检测设备相对简单、使用方便、构制敏感电极方法灵活、体系容易集成化、微型化等优点，发展新型电化学免疫传器也是目前较活跃的研究领域。本论文报道了以日本血吸虫和布氏杆菌为模式免疫试剂，研究几种固定基质材料和固定方法并以之为基础分别制作一次性的和可更新的免疫组分支撑体；开发了二种新型荧光底物，以其为基础设计制备了荧光免疫流通传感装置；针对电化学免疫传感器在实际应用中所碰到的传感器表面再生难和固定生物组分易失活的问题，采用sol-gel技术分别固定完整的布氏杆菌和新城疫病毒构制了一种可再生性电化学免疫传感器，使敏感层具有较大的免疫活性和较好的再生稳定性。另外，针对目前电化学DNA传感器研究中的热点问题：DNA探针固定和杂交指示，我们在电化学DNA传感器方面开展了一定的工作，分别研究了以天然高分子壳聚糖为桥梁固定DNA探针，中性红为杂交指示剂和以电聚合中性红膜掺杂壳聚糖固定DNA探针，免杂交指示剂的电化学DNA传感器。具体内容如下： (1)在第二章中报道了以纳米金／PVC为载体材料固定布氏杆菌抗体，制备一种一次性的生物组分支持体；首次建立了以8-羟基喹啉镁络合物为辣根过氧化物酶底物的酶联荧光反应体系；首次采取在酶反应体系中介入扰动剂4-氨基安替比林扰动酶反应平衡的办法实现了信号的放大，该技术用于布氏杆菌抗原的测定，检测下限达到0.35ng／mL。(2)在第三章和第四章中分别报道了以溶胶一凝胶技术、石蜡／微晶纤微素为包埋基质固定日本血吸虫抗原和布氏杆菌抗原，制备一种可更新的生物组分支持体；以辣根过氧化物酶(HRP)为标志酶通过测定其催化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)氧化引起的荧光降低来定量样品中日本血吸虫抗体或布氏杆菌抗体的浓度，检测下限分别达到4.5ng／mL和2.7ng／mL。这种方法提高了上述免疫试剂摘要检测的灵敏度，较好的解决了酶联荧光免疫传感技术中生物组分支撑体重复使用性和生物组分活性保持的问题。(3)在第五章中报道了以阿魏酸为HRP酶底物的酶联荧光免疫传感技术。阿魏酸是HRP天然底物，对HZOZ相对稳定，该底物的应用降低了传感体系误差，用于日本血吸虫抗体的测定，检测下限为45ng/mL。(4)在第六章、第七章中报道了以溶胶一凝胶技术分别包埋完整布氏杆菌和新城疫病毒，以。氨基酚和TMB为酶联底物的两种可更新电化学免疫传感器。溶胶一凝胶温和包埋条件有利于布氏杆菌和和新城疫病毒抗原活性的保持，固定完整布氏杆菌细胞可以克服使用纯蛋白抗原需分离、纯化所带来的麻烦而且有利于抗原活性保持，这种传感器表面通过简单的抛光而更新，克服了免疫传感器应用中免疫组分再生难的问题。该技术对布氏杆菌抗体和新城疫病毒抗体检测下限分别为3.5林g/mL和n.1林g/mL。 (5)在第八章中报道了以天然高分子壳聚糖为桥梁分子共价固定DNA探针，中性红为杂交指示剂的可再生性电化学DNA传感器。本文建议的固定方法简便，固定的DNA探针稳定;中性红杂交指示剂为非致癌物使用安全。这种传感器的线性响应范围为10一5一10一”M/L，检测下限为10一，’M/L。(6)在第九章中报道了基于具电化学活性聚中性红膜的DNA传感器。利用单链和双链与电聚合中性红膜的作用的区别，杂交前后膜的电化学性质改变进而引起响应电流变化来测定DNA杂交，这种非标志、无杂交指示剂的DNA传感器大大简化了DNA测定程序，其检测下限为10一’0M/L。(7)在第十章中报道了以金属叶琳为分子识别元件，利用待测物本身活性基团一NOZ作电化学信号源的电化学甲硝哇传感器，制备的传感器能对甲硝哩进行选择性测定而且性能稳定，其表面可以更新重复利用至少200次，用于甲硝哇药物检测，检测下限为5.sxlo一sM/L，可以满足临床和药理的需要。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章绪言  11-22
  1.1 免疫传感器  11-19
    1.1.1 免疫传感器的发展  11-12
    1.1.2 免疫传感器的分类  12-15
    1.1.3 免疫传感器的定量方法  15-17
    1.1.4 免疫传感器的固定方法  17-18
    1.1.5 免疫传感器的应用  18-19
  1.2 电化学DNA传感器  19-20
  1.3 本文工作设想  20-22
第二章基于酶反应平衡扰动信号放大的荧光免疫新方法的研究  22-32
  2.1 前言  22-23
  2.2 实验部分  23-25
  2.3 结果与讨论  25-31
  2.4 结论  31-32
第三章基于溶胶-凝胶技术及可更新的荧光免疫传感技术用于日本血吸虫抗体的测定  32-42
  3.1 前言  32
  3.2 实验部分  32-35
  3.3 结果与讨论  35-41
  3.4 结论  41-42
第四章基于石蜡固定布氏杆菌的可更新荧光免疫传感系统用于布氏杆菌抗体的测定  42-51
  4.1 前言  42-43
  4.2 实验部分  43-44
  4.3 结果与讨论  44-50
  4.4 结论  50-51
第五章基于阿魏酸的酶联荧光免疫传感技术用于日本血吸虫抗体的检测  51-59
  5.1 前言  51
  5.2 实验部分  51-53
  5.3 结果与讨论  53-58
  5.4 结论  58-59
第六章基于固定布氏杆菌细胞的电流型免疫传感器的研究  59-69
  6.1 前言  59-60
  6.2 实验部分  60-63
  6.3 结果与讨论  63-68
  6.4 结论  68-69
第七章一种安培型免疫传感器用于新城疫病毒抗体的测定  69-80
  7.1 前言  69-70
  7.2 实验部分  70-72
  7.3 结果与讨论  72-79
  7.4 结论  79-80
第八章基于壳聚糖固定和中性红杂交指示DNA传感器的研究  80-88
  8.1 前言  80-81
  8.2 实验部分  81-82
  8.3 结果与讨论  82-87
  8.4 结论  87-88
第九章基于电聚合中性红膜的无指示剂DNA传感器的研究  88-97
  9.1 前言  88-89
  9.2 实验部分  89-91
  9.3 结果与讨论  91-96
  9.4 结论  96-97
第十章以金属卟啉为分子识别载体的甲硝唑电流型传感器  97-106
  10.1 前言  97-98
  10.2 实验部分  98-99
  10.3 结果与讨论  99-105
  10.4 结论  105-106
结论  106-108
致谢  108-109
参考文献  109-125
附录(攻读学位期间相关论文目录)  125-126

新型酶联荧光、电化学免疫及DNA传感技术的研究

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