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人乳铁蛋白基因在胡萝卜（Daucus carota L.）中的表达及其功能研究

作　者: 郑回勇
导　师: 郑金贵
学　校: 福建农林大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 人乳铁蛋白基因 遗传转化 胡萝卜 抗菌活力 铁含量
分类号: Q786
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


乳铁蛋白是一种糖蛋白，为转铁蛋白家族的一员，在人和哺乳动物的许多器官与组织中广泛分布。乳铁蛋白具有多种生物学功能，这些功能包括：促进人体肠道对铁的吸收及调节体内铁的平衡；广谱抗菌（细菌和真菌）、抗病毒感染作用等。把人乳铁蛋白基因转入富含类胡萝卜素和植物纤维的胡萝卜，让它合成具有生物活性的人乳铁蛋白，相当于在营养丰富的胡萝卜中添加新的营养保健因子。乳铁蛋白强的铁螯合能力和广谱抗菌、抗病功能，可提高转基因胡萝卜铁的含量，增强胡萝卜抗菌、抗病能力。 本研究在对胡萝卜组织培养及遗传转化体系进行优化的基础上，构建了人乳铁蛋白基因植物表达载体，在农杆菌介导下，首次把人乳铁蛋白基因导入胡萝卜，获得了转基因植株。对转基因植株进行分子检测，证实了外源基因已整合到胡萝卜基因组中。功能研究和成分测定表明，转基因胡萝卜具有抗菌活性，其铁含量也得到提高。具体结果如下： 1．建立了高效的胡萝卜组织培养及再生体系 以适于生产饮料的胡萝卜“新黑田五寸人参”为材料，研究不同外植体、不同培养基，不同培养条件对胡萝卜愈伤诱导及再生的影响，建立一套高效的胡萝卜组织培养再生体系：最适于诱导愈伤的外植体是弱光或黑暗下发芽7-10d无菌苗下胚轴，最适合的愈伤诱导培养基和继代培养是B5C（B5+0.5mg／L 6BA+0.5mg／L2，4-D），最适于植株再生的培养基为不添加任何激素的B5或MS，组织培养条件为25℃、光照周期为16hr／8hr。适当照射日光对植株再生具有很好的促进作用。 2．建立了高效的遗传转化体系 以pBI121和pTOK233为转化质粒，在农杆菌LBA4404介导下，对胡萝卜遗传转化体系进行系统研究，首次为该胡萝卜品种建立一套高效的遗传转化体系，结果为:最适转化受体为新鲜下胚轴及经预培养的下胚轴;共培养时，低浓度的乙酞丁香酮（25 pM）对转化具有促进作用;适宜的卡那霉素筛选浓度是loom岁L。筛选时，卡那霉素浓度先低后高，植株再生时完全去除，有利于缩短植株再生周期。3.人乳铁蛋白基因在胡萝卜中的转化及分子检测 以pBll21为中间载体，把人乳铁蛋白基因替换到GUS位置上，构建成表达载体pBIhLF。在农杆菌LBA4404介导下，把目的基因导入胡萝卜，获得了外表正常的抗性植株。PCR检测、Southem杂交证实了外源基因已整合到抗性植株基因组DNA中。对转基因植株进行RT一PCR检验，得到了阳性结果，说明外源基因在胡萝卜中能正常转录。4.转基因植株抗菌能力加强，铁含量得到提高 提取转基因植株叶片粗蛋白，以大肠杆菌DHSQ和酵母菌AHIOg为试验靶标，侧定了转基因植株粗蛋白的抑菌活性。结果表明，转基因植株叶片粗蛋白对DH5a有强烈的抑制作用（当培养基中粗蛋白为lmg/ml时，每ml菌数为对照的1.47%），对AH109的抑制作用较弱。按GB汀13883一92标准测定了部分转基因植株叶片中铁含量。在测定的植株中，铁的含量都得到提高，其中一株提高64%。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 作物营养品质遗传工程改良及乳铁蛋白遗传转化研究进展  12-43
  1 作物营养素的遗传工程改良  12-33
    1.1 作物蛋白质的遗传工程改良  13-21
      1.1.1 主要种子贮存蛋白的理化特征  13-14
      1.1.2 利用遗传工程手段提高贮藏蛋白必需氨基酸含量  14-18
        1.1.2.1 导入经改造的贮藏蛋白基因  15
        1.1.2.2 导入天然蛋白基因  15-17
        1.1.2.3 导入人工合成蛋白基因  17-18
      1.1.3 利用遗传工程手段增加必需氨基酸的合成  18-21
    1.2 脂肪酸的遗传工程改良  21-24
      1.2.1 降低多不饱和脂肪酸含量  21-22
      1.2.2 让作物合成长链多非饱和脂肪酸  22-24
      1.2.3 作物长链脂肪酸的合成  24
    1.3 微量营养素的遗传工程改良  24-33
      1.3.1 作物矿质元素(铁)的遗传工程改良  26-31
        1.3.1.1 提高作物对铁的吸收  27-29
        1.3.1.2 提高作物铁贮存能力  29-31
      1.3.2 维生素A  31-32
      1.3.3 维生素E  32-33
  2 乳铁蛋白的遗传转化研究进展  33-41
    2.1 分子生物学特性  33-38
      2.1.1 结构与分布  33-35
      2.1.2 生物功能  35-38
    2.2 乳铁蛋白基因的遗传转化研究进展  38-41
  3 本研究项目的意义  41-43
第二章 胡萝卜再生体系及遗传转化体系的建立  43-58
  1 材料与方法  44-47
    1.1 实验材料  44-45
      1.1.1 植物材料  44
      1.1.2 菌株和质粒  44
      1.1.3 化学试剂及生长调节剂  44
      1.1.4 组织培养及遗传转化用培养基  44-45
      1.1.5 GUS染色液  45
    1.2 实验方法  45-47
      1.2.1 组织培养及植株再生  45-46
        1.2.1.1 无菌苗的获得  45
        1.2.1.2 外植体处理  45
        1.2.1.3 愈伤诱导  45-46
        1.2.1.4 植株再生培养  46
      1.2.2 遗传转化  46
      1.2.3 GUS染色  46-47
        1.2.3.1 瞬时表达检测  46-47
        1.2.3.2 转基因植株检测  47
  2 结果与分析  47-54
    2.1 胡萝卜的组织培养及植株再生  47-50
      2.1.1 不同外植体对愈伤诱导的影响  47
      2.1.2 不同培养基对愈伤组织诱导的影响  47-48
      2.1.3 不同培养基对植株再生的影响  48-50
    2.2 根癌农杆菌转化胡萝卜  50-54
      2.2.1 不同外植体对胡萝卜的遗传转化的影响  50-52
      2.2.2 乙酰丁香酮对遗传转化的影响  52
      2.2.3 胡萝卜抗生素致死浓度试验  52-53
      2.2.4 转基因植株再生及GUS检测  53-54
  3 讨论  54-58
第三章 人乳铁蛋白基因在胡萝卜中表达研究  58-80
  1 材料与方法  59-69
    1.1 实验材料  59-62
      1.1.1 植物材料  59
      1.1.2 菌株与质粒  59
      1.1.3 工具酶及试剂  59
      1.1.4 PCR引物  59
      1.1.5 主要溶液配制  59-62
    1.2 实验方法  62-69
      1.2.1 载体构建及转化  62-64
        1.2.1.1 载体构建  62
        1.2.1.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化  62-63
        1.2.1.3 农杆菌感受态细胞制备转化  63-64
      1.2.2 胡萝卜的遗传转化及植株再生  64
      1.2.3 PCR检测  64-65
      1.2.4 Southern blot  65-67
        1.2.4.1 DNA大量抽提  65-66
        1.2.4.2 电泳及转膜  66
        1.2.4.3 Southern杂交  66-67
      1.2.5 RT-PCR  67-69
  2 实验结果  69-75
    2.1 载体构建  69-71
    2.2 遗传转化  71-72
    2.3 PCR检测  72-73
    2.4 Southern blot  73-75
    2.5 RT-PCR  75
  3 讨论  75-80
第四章 转基因胡萝卜的抑菌特性和铁锌含量初步研究  80-87
  1 材料与方法  80-82
    1.1 实验材料  80-81
      1.1.1 植物材料  80
      1.1.2 用于抗菌试验的菌株  80
      1.1.3 主要溶液配制  80-81
    1.2 实验方法  81-82
      1.2.1 蛋白质提取  81
      1.2.2 抑菌试验  81
      1.2.3 铁含量测定  81
      1.2.4 锌含量测定  81-82
  2 试验结果  82-85
    2.1 转基因胡萝卜抑菌试验  82-84
      2.1.1 对大肠杆菌DH5a的抑菌作用  82
      2.1.2 对酶母AH109的抑制作用  82-84
    2.2 转基因胡萝卜对矿质元素含量的影响  84-85
      2.2.1 转基因胡萝卜叶片中铁的含量  84
      2.2.2 转基因胡萝卜叶片中锌的含量  84-85
  3 讨论  85-87
参考文献  87-102
在学期间发表论文列表  102-103
致谢  103

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因的表达
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