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对虾白斑综合征病毒在螯虾的增殖与动态分布及其基因组片段的测序、克隆与表达

作　者: 朱建中
导　师: 陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 白斑综合征病毒螫虾增殖特性动态分布序列测定与分析克隆与表达
分类号: S945.1
类　型: 博士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

应用生活于淡水的克氏原螯虾（Cambrus proclakii，简称螯虾）作为动物模型，研究对虾白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV前称无包埋体对虾病毒，NOSV）在动物体内的增殖特性和机理，同时测定分析WSSV基因组片段序列，并将其中的一个阅读框进行了克隆和初步表达。 1．将对虾白斑综合征病毒（WSSV）接种螯虾，研究其感染增殖特性，涉及感染温度、感染途径、继发感染、半数致死量、免疫保护及保存期等。结果显示病毒增殖随温度升高而加快，温度降低对病毒增殖影响较显著。腹节肌肉、腹节皮下注射及口服WSSV均能使螯虾感染发病，而浸泡WSSV不能使螯虾发病。在螯虾感染后期，螯虾肝胰腺和心脏内的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）大量增殖，形成继发感染。WSSV对螯虾的LD₅₀为10^-6.5/ml病毒液。灭活病毒免疫螯虾不能使螯虾形成免疫保护。病毒在整体螯虾冻存较匀浆液优越，保存1年后仍有活力。 2．以螯虾为动物模型，检测药物和消毒剂对WSSV的作用，结果显示，用不同浓度的两种抗病毒药物浸泡螯虾后，螯虾死亡时间较对照组平均延长1.2～2d，其中的一种中药制剂较另一种药物略胜一筹。同时将WSSV分别用两类消毒剂37℃作用10min，再感染螯虾，结果表明，两者能抑制病毒活性，但未能有效灭活病毒。 3．制备WSSV单克隆抗体，建立单抗介导ELISA，同时制备WSSV基因探针，用于DOt-blot检测。从WSSV感染螯虾中提纯病毒，纯化病毒免疫BalB/C小鼠，采用细胞融合法获得4株杂交瘤细胞，四株单抗均属IgM。其中一株4E₅在免疫转印中与37.5K左右的病毒条带呈阳性反应，用此株单抗作一抗，建立检测病毒蛋白的间接ELISA法，该方法能检测出感染组织中的病毒，而正常螯虾组织呈阴性。从重组质粒pAFD中回收WSSV 400bp大小基因组片段，用地高辛标记后制备探针，作DOt-blot，能灵敏、特异地检出感染组织中的WSSV。单抗介导ELISA和Dot-blot检测结果具有较好的一致性，后者较前者灵敏。南京农业大学博土学位论文 4．苗虾口服、肌注感染WSSV青岛株，斑点杂交与单抗介导ELISA检测体内动态分布。口服和肌注螫虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中出现，然后从血淋巴中消失，但口服组整虾在感染后96h，大量病毒又在血淋巴中出现，并维持到12加；口服36h和肌注24h，病毒在兹虾心脏和肌肉中同时出现，然后呈总体递增分布：此外，病毒在螫虾肠上皮、卵巢、真皮和结缔组织也有不同程度分布。感染死亡螫虾各主要组织器官均可检出病毒，口服组真皮含毒量最高，肌注组肠上皮、鳃、真皮、卵巢含毒量较高，表明此时病毒已形成周身感染。 5．用自行分离的WSSV射阳株感染螫虾，用斑点杂交和单抗ELISA检测其动态分布，并与WSSV青岛株相比较。鳖虾在口服和肌注感染后12h，射阳株首先在血淋巴中检出，36h时在肠上皮、心脏、肌肉中同时出现，井呈总体递增分布。斑点杂交、单抗ELISA和电镜观察均可从死亡袒虾各主要组织器官检出病毒，显示死亡凿虾内病毒已形成周身！4染。椎测WSSV首先进入血淋巴，然后扩散到心脏、肌肉、肠上皮等组织器官并在其内增殖，继而再次释放到血淋巴，最终形成周身感染直至赘虾死亡。与WSSV青岛株在繁虾的体内动态大体相仿。 6．取WSSV基因组随机文库中一个大小约skb的克隆片段测序，DNA序列用 DNA Sfor软件进行分析，共发现 43个 100hp以上开放性阅读框架（Ony），其中一条链31个，互补链12个。用BLAST软件将43个Ony及其推导的氢基酸序列分别与GeneBank中核酸蛋白数据库序列进行同源性比较，结果无显著同源性。在此测序片段中，发现一个 sl obp阅读框架，其编码氢基酸序列与海栖热袍菌外膜蛋白具有24％的同源性，设计一对引物，扩增该阅读框，用T载体克隆，并按正确阅读框架连接到大肠杆菌表达载体pGEX－6P－l上。重组菌经IPTG诱导后，菌体SDS－PAGE显示有一个大小为56K的融合表达蛋白产生。

全文目录

中文摘要  5-7
前言  7-8
第一篇文献综述  8-35
  第一章对虾病毒研究进展  8-18
    1 对虾DNA病毒  8-15
    2 对虾RNA病毒  15-18
  第二章对虾白斑综合征病毒研究进展  18-35
    1 对虾白斑综合征及其发生、发展  18
    2 对虾白斑综合征的症状和病理变化  18-19
    3 对虾白斑综合征病原命名  19-20
    4 WSSV的形态结构、多肽和基因组  20-23
    5 WSSV的分类地位  23-25
    6 WSSV的检测  25-28
    7 WSSV在对虾体内的感染增殖  28-30
    8 WSSV的感染宿主、感染途径及感染动物模型  30-33
    9 WSSV的细胞培养  33
    10 对虾白斑综合征的防治  33-35
参考文献  35-46
第二篇研究报告  46-113
  第一章对虾白斑综合征病毒在螯虾动物模型的增殖特性  46-54
    1 材料和方法  46-48
    2 结果  48-51
    3 讨论  51-54
  第二章用动物模型检测药物和消毒剂对对虾白斑综合征病毒的作用  54-59
    1 材料与方法  54-55
    2 结果  55-56
    3 讨论  56-59
  第三章检测白斑综合征病毒单抗介导ELISA的建立  59-69
    1 材料与方法  59-62
    2 结果  62-66
    3 讨论  66-69
  第四章斑点杂交和单抗介导ELISA检测白斑综合征病毒青岛株在螯虾的动态分布  69-81
    1 材料与方法  69-72
    2 结果  72-75
    3 讨论  75-81
  第五章白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾的动态分布  81-93
    1 材料与方法  81-82
    2 结果  82-90
    3 讨论  90-93
  第六章白斑综合征病毒基因组随机文库克隆的序列测定及分析  93-102
    1 材料与方法  93-94
    2 结果  94
    3 讨论  94-102
  第七章白斑综合征病毒基因组一个阅读框架的克隆及在大肠杆菌中的表达  102-113
    1 材料和方法  102-106
    2 结果  106-110
    3 讨论  110-113
全文总结  113-114
英文摘要  114-117
致谢  117

对虾白斑综合征病毒在螯虾的增殖与动态分布及其基因组片段的测序、克隆与表达

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