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bFGF及SOX-9基因转染骨髓基质细胞组织工程修复软骨缺损

作　者: 徐忠世
导　师: 杨述华；肖德明
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓基质细胞细胞培养组织工程软骨缺损基因工程碱性成纤维细胞因子 SOX-9基因聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物
分类号: R687.3
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

本研究通过兔骨髓基质细胞培养,采用基因转染技术,将bFGF及SOX-9基因转染至骨髓基质细胞中,并以聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)为载体在体外进行组织工程培养骨髓基质细胞向成软骨分化。然后将培养后的转染骨髓基质细胞-载体复合物植入兔关节软骨缺损模型内,观察软骨修复缺损效果及成软骨作用。我们通过以下三部分进行研究:第一部分骨髓基质细胞的体外培养及鉴定目的体外分离培养兔骨髓基质细胞并进行鉴定,为组织工程提供适宜的种子细胞。方法抽取新西兰白兔红骨髓,在体外分离纯化获取骨髓基质细胞,分别用倒置显微镜观察骨髓基质细胞的增殖分化,用HE染色光镜下观察对细胞进行鉴定,用MTT法描绘细胞生长曲线,并对传代培养的细胞进行冻存复苏。结果骨髓基质细胞在在培养皿中贴壁生长、增殖,经鉴定为单核细胞;细胞生长曲线显示在接种后前6天细胞持续旺盛生长,第8天细胞活力最高;复苏冻存56天的细胞,培养发现细胞依然生长良好,增长迅速。结论可以通过在体外分离纯化骨髓基质细胞并传代培养、冻存复苏,获得足够数量有多向分化潜能骨髓基质细胞,可作为组织工程的种子细胞。第二部分bFGF与SOX-9真核表达质粒的构建以及骨髓基质细胞转染目的:探讨bFGF与SOX-9基因转染骨髓基质干细胞的方法及可行性。方法:构建bFGF与SOX-9基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染骨髓基质细胞,通过形态学观察、免疫组化、ELISA法、及RT-PCR方法检测bFGF与SOX-9基因转染骨髓基质干细胞的成功性,以及转染后骨髓基质干细胞的生物学特性。结果:bFGF与SOX-9基因成功转染骨髓基质细胞,并能持续稳定的分泌bFGF与SOX-9蛋白,并诱导骨髓基质细胞向成软骨方向分化。结论:bFGF与SOX-9基因可以转染骨髓基质干细胞,并能诱导骨髓基质细胞向成软骨方向分化。第三部分转染后骨髓基质细胞组织工程培养及修复软骨缺损的动物试验目的:探讨bFGF与SOX-9基因转染骨髓基质干细胞后在PLGA培养生长的生物相容性,以及采用组织工程方法培养的骨髓基质细胞-PLGA复合物修复软骨缺损动物模型的可行性。方法:将bFGF与SOX-9基因转染成功后的骨髓基质细胞在PLGA培养生长,制备软骨缺损动物模型,将复合物植入软骨缺损,通过大体标本观察、组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组化及RT-PCR检测对软骨缺损模型的修复效果。结果:bFGF与SOX-9基因转染骨髓基质干细胞后可以在PLGA上正常生长,并有Ⅱ型胶原的高表达,将复合物植入软骨缺损后,可以修复软骨缺损动物模型。结论:PLGA与转染后的骨髓基质细胞具有良好的生物相容性,转染后的骨髓基质细胞与PLGA复合物可以修复兔软骨缺损动物模型,可以作为自体软骨移植的一种替代治疗方法。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-14
第一部分骨髓基质细胞的体外培养及鉴定  14-26
  0 引言  14
  1 材料与试剂  14-16
  2 实验方法及检测指标  16-18
  3 实验结果  18-23
  4 讨论  23-25
  5 结论  25-26
第二部分 BFGF 与 SOX-9 真核表达质粒的构建及骨髓基质细胞转染  26-54
  0 引言  26-27
  1 材料与试剂  27-29
  2 骨髓基质细胞原、传代培养  29
  3 质粒构建  29-30
  4 质粒转染兔骨髓基质细胞  30
  5 转染效果测定  30-32
  6 实验结果  32-51
  7 讨论  51-53
  8 结论  53-54
第三部分转染后骨髓基质细胞组织工程培养及修复软骨缺损的动物试验  54-68
  0 引言  54
  1 材料与试剂  54-56
  2 实验方法  56-58
  3 实验结果  58-64
  4 讨论  64-67
  5 结论  67-68
参考文献  68-75
致谢  75-76
附录一读博期间发表文章  76-78
附录二英文缩略词  78

bFGF及SOX-9基因转染骨髓基质细胞组织工程修复软骨缺损

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