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霍乱弧菌ToxR调控单元中毒力基因的调控机制研究

作　者: 徐潇
导　师: 高守一；阚飙；Jun Zhu
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 病原生物学
关键词: 霍乱弧菌 ToxR调控单元 aphB MSHA VBNC状态转录组分析
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

霍乱弧菌是霍乱的病原体,其两个主要的毒力决定子是霍乱毒素CT和毒素共调菌毛TCP,CT能够引起霍乱样的腹泻,TCP则是霍乱弧菌能够黏附并定植在小肠上皮的必要条件。大量的研究表明,复杂的调控级联调节着霍乱弧菌这些毒力基因的表达。其中,霍乱弧菌毒力基因ctxAB和tcpA均受到霍乱弧菌主要的直接转录激活子ToxT的调控,ToxT属于AraC/Xyls家族。除此之外,ToxT还能抑制msh操纵子的转录。而ToxT的表达又受ToxR和另外一个转录激活子TcpP的共同调控。并且,ToxR还可激活外膜蛋白基因ompU、抑制外膜蛋白基因ompT的转录。本课题中,我们研究了霍乱弧菌关键毒力调控子ToxR在不同条件下的表达水平,并发现在生长平台期,与野生株相比,aphB缺失株中toxR的表达降低。AphB之前已经被证明能够和AphA相互作用共同激活tcpP,本研究中电泳迁移率变动分析表明AphB能够直接结合在toxR的启动子区,并进而激活toxR的启动子。而且,AphB能够通过对toxR表达的影响进而调节toxT的表达。我们还分析了AphB对ToxR调控的外膜蛋白OmpT和OmpU的作用。这些结果显示,霍乱弧菌存在着另外一条调控回路,即AphB激活两个毒力调控子ToxR和TcpP,ToxR和TcpP一起调节主要毒力调控子ToxT的表达。ToxT在致病过程中发挥关键性的作用,可以调控两种四型菌毛：甘露糖敏感血凝素MSHA和毒素共调菌毛TCP。MSHA作为一种抗定植因子,它的表达不利于霍乱弧菌在宿主内生存定居。之前的研究认为,ToxT需要二聚体的形成才可以发挥其调控转录的作用。我们的实验发现并证明了ToxT可以通过结合在msh操纵子的启动子区,进而直接抑制msh操纵子的转录,并且不需要形成二聚体这一转录抑制即可发生,提示,ToxT使用了不同的机制来调节霍乱弧菌所有组成部分的转录。霍乱弧菌是引起霍乱的病原菌,并广泛存在于水生环境中。生存环境的恶劣,可以导致霍乱弧菌进入一种特殊的状态——活的非可培养(Viable but nonculturable, VBNC)状态,使用常规的实验室检测技术不能检出这种特殊状态的霍乱弧菌,但其仍具有致病性,动物实验也发现经肠道复苏可致病。在本研究中,我们在实验室环境中成功诱导了霍乱弧菌进入VBNC状态。在这一过程中,我们使用平板菌落计数描述了可培养细菌数的趋势,以及通过使用LIVE/DEAD荧光染色方法,观察了活菌百分比的变化。而且,我们比较了在低温低营养条件下培养了4小时和24小时的细胞与在丰富培养基中处于对数生长期的细胞的整体转录水平,并描述了在这两个时间点的基因表达情况。我们发现超过300个基因均发生了改变,同时我们选取了一对toxin-antitoxin基因(VCA0391/2)进行研究,观察其是否能够帮助霍乱弧菌在恶劣条件下逃避死亡

全文目录

目录  4-5
缩略语  5-6
第一部分霍乱弧菌ToxR调控单元中毒力基因的调控机制研究  6-56
  摘要  7-9
  Abstract  9-11
  前言  11-14
  一、霍乱弧菌ToxR调控单元中AphB对toxR的直接调控作用  14-42
    1 材料与方法  14-27
    2 结果  27-42
  二、霍乱弧菌ToxT调控蛋白直接调节定植和抗定植菌毛的表达  42-52
    1 材料与方法  42-45
    2 结果  45-52
  讨论  52-55
  小结  55-56
第二部分诱导霍乱弧菌进入VBNC状态前期的转录组分析  56-79
  摘要  57-58
  Abstract  58-59
  前言  59-61
  1 材料与方法  61-66
  2 结果  66-76
  讨论  76-78
  小结  78-79
参考文献  79-87
已发表文章  87-88
综述  88-97
致谢  97

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