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SEMA4C调节肿瘤微环境中肿瘤细胞和淋巴内皮细胞的交互作用促进肿瘤淋巴转移

作　者: 蒋学锋
导　师: 马丁
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科
关键词: SEMA4C 上皮性肿瘤高转移潜能角膜微袋模型成管实验淋巴管新生体内模型交互作用淋巴内皮细胞肿瘤微环境淋巴转移
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肿瘤细胞从原发灶扩散到淋巴结是发生在人类恶性肿瘤的早期和共同事件,淋巴转移是许多恶性肿瘤的主要转移方式,淋巴结转移灶的存在被认为与恶性肿瘤病人的预后不良密切相关。尽管全世界众多的科学家都对肿瘤转移进行了孜孜不倦的探索,但关于肿瘤淋巴转移的机制目前仍没有明确的结论。肿瘤的淋巴转移是一系列连续的生物学过程,包括原发灶的肿瘤细胞增殖、分离、运动、进入淋巴管、达到各级淋巴结,然后通过淋巴系统达到血液循环系统直至远处。在这个过程中,肿瘤微环境为肿瘤细胞的转移提供了一个“转移前小环境”,肿瘤细胞在这个环境中通过与微环境中的其他细胞如巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞、周细胞、淋巴内皮细胞、肥大细胞、细胞外基质等相互作用,增强转移的能力。研究肿瘤微环境中这些细胞与肿瘤恶性行为的研究比较多,比如肿瘤相关巨噬细胞、成纤维细胞和各种淋巴细胞；而关注它们间的相互作用的文献较少,研究内皮细胞尤其是淋巴内皮细胞与肿瘤细胞间相互作用的文献就更少了。这既与人们对肿瘤微环境中淋巴内皮细胞在肿瘤淋巴转移的认知程度有关,也与研究技术和手段的限制有关。随着研究的不断深入,研究技术和手段的不断改进,新的淋巴管内皮细胞特异性标记物的不断出现,给研究肿瘤微环境中的淋巴内皮细胞及其与肿瘤细胞的相互作用提供了良好的契机。SEMA4C作为semaphorin家族第四亚家族的一个成员,目前关于它的研究较少,但涉及的领域却较为广泛,包括神经轴突的导向、大脑颗粒细胞前体细胞的增殖和迁移、肌管分化、潜在调节β-catenin信号在色素沉着和神经支配中的效应,最近还有文献报道它在在神经干细胞／前体细胞和成年大鼠大脑缺血损伤后神经发生过程中表达。虽然SEMA4C文献所涉及的范围比较广泛,但是研究它与肿瘤的发生、发展和进展的研究很少,NCBI中还没有直接相关的外文文献报道。国内本实验室利用激光捕获显微切割技术结合cDNA微矩阵筛选乳腺癌相关淋巴内皮细胞基因时,首次发现人SEMA4C基因在乳腺癌组织淋巴内皮细胞中高表达,而在正常乳腺乳腺癌淋巴管内皮细胞表达较低。并发现SEMA4C与乳腺癌组织中淋巴管新生相关,SEMA4C的表达与肿瘤淋巴结转移的具有相关性;SEMA4C能够影响淋巴内皮细胞的运动和成管能力；实验证明SEMA4C通过促进肿瘤相关巨噬细胞整合到肿瘤新生淋巴内和改变肿瘤微环境中免疫平衡促进肿瘤的淋巴转移。此外,研究验证了SEMA4C在6种常见的恶性肿瘤中表达情况,发现SEMA4C不仅在肿瘤相关淋巴内皮细胞中表达,在肿瘤细胞中也有表达,并且与肿瘤的发生和转移相关,直接地影响肿瘤细胞的增殖运动和侵袭能力,并对其机制进行了初步的研究(以上内容均未发表)。除了本实验室前期的工作外,国内还有人报道SEMA4C在上皮性卵巢癌中的表达明显高于正常卵巢组、良性和交界性肿瘤组,其表达水平与病理级别和临床分期相关；通过对75例上皮性卵巢癌患者的随访研究发现SEMA4C阳性表达组的5年累计生存率和中位生存时间低于阴性组,差异具有统计学意义,但SEMA4C不是影响上皮性卵巢癌预后的独立危险因素。本研究在本实验室前期研究的基础上,主要研究了淋巴转移相关基因SEMA4C在30种不同肿瘤细胞中的表达谱,并采用组织芯片进行了组织水平的验证,对肿瘤细胞细胞骨架、侵袭转移能力,以及通过影响淋巴内皮细胞分泌的细胞因子影响肿瘤细胞向淋巴内皮细胞的运动和淋巴转移。从肿瘤微环境中肿瘤细胞和淋巴内皮细胞的交互作用的角度对淋巴转移相关基因对SEMA4C促进淋巴转移的机制进行了初步的探讨。收集30种肿瘤细胞系及2种永生化正常细胞系,应用Trizol抽提总RNA,荧光实时定量PCR方法检测SEMA4C基因的表达。应用免疫组织化学技术检测500点高密度组织芯片中20种人类常见类型的癌及正常组织(膀胱、骨、乳腺、脑、结肠、脂肪组织、纤维组织、头颈、小肠、肾、肝、肺、淋巴结、肠系膜、卵巢、胰腺、前列腺、腹膜后腔、皮肤、脾、胃、睾丸、甲状腺和子宫)中SEMA4C的组织表达水平及定位特点,癌每种20例,正常每种5例。将bac-to-bac杆状病毒系统表达的人重组SEMA4C融合蛋白制成统一大小的缓释颗粒,使用角巩膜切开刀在小鼠眼球下方距离角巩缘约1mm的角膜上制作一微袋,将含人重组SEMA4C融合蛋白的缓释微粒或对照微粒植入微袋,分别于术后第3、5、7、14天将小鼠处死,取出整个小鼠眼球,用包埋剂包埋后送冰冻切片,或取出角膜进行全角膜包埋免疫荧光实验。荧光显微镜下观察角膜的新生淋巴管。设计并合成4对针对人类SEMA4C基因的特异性shRNA序列,将其构建到pGC-LV慢病毒辅助载体上,转化宿主菌,然后提取质粒转染MDA-MB-231细胞,验证其封闭效果,从中挑选出一条封闭效果最好的shRNA序列,送专业生物公司进行病毒包装,获得重组的编码特异性针对SEMA4C基因shRNA的带绿色荧光蛋白(GPF)标签的病毒。使用该病毒或对照病毒转染MDA-MB-231肿瘤细胞和人淋巴内皮细胞(HLEC),培养后获得稳定敲除SEMA4C基因和对照病毒细胞株。使用IL-8酶联免疫试剂盒(ELISA Kit)检测SEMA4C敲除和对照组HLEC的条件培养基中IL-8水平,同时将这两种条件培养基加入Transwell试剂盒下室,检测不同细胞来源的HLEC条件培养基对上室MDA-MB-231肿瘤细胞的运动能力的影响。使用共聚焦显微镜观察SEMA4C敲除组和对照组MDA-MB-231肿瘤细胞的细胞骨架。1.SEMA4C在30种肿瘤细胞中的大多数细胞中有表达,上皮来源性的肿瘤细胞系中表达丰度高,显著高于其在永生化正常细胞系如MCF-10A和BEAS-2B细胞中的表达水平。2.蛋白免疫印记实验证实从蛋白水平证实了Real-time-PCR的结果,Western blot分析发现在转移潜力高的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中SEMA4C的表达高于转移潜力较低的MCF-7细胞；在前列腺癌肿也发现了相似的趋势,在转移潜力较高的PC-3M-1E8细胞中SEMA4C的表达高于转移潜力较低的PC-3M-2B4细胞。3.500点样品的包含20种不同类型的肿瘤和正常组织的高密度组织芯片(每种25例,每类5例正常组织)免疫组织化结果显示SEMA4C在多种类型肿瘤组织及正常组织中均有表达。而且在黑色素瘤和正常皮肤组织,乳腺癌和正常乳腺组织,胃癌和正常胃组织中SEMA4C的表达差异具有统计学意义。在黑色素瘤、乳腺癌和卵巢癌组织中,SEMA4C表达水平明显高于其在正常皮肤组织及正常乳腺组织中的表达。相反,SEMA4C在胃癌组织中的表达水平明显低于其在正常胃组织中的表达。SEMA4C的阳性表达率在其他类型的肿瘤组织和正常组织中差异没有显著性。4.人重组SEMA4C融合蛋白在体外能够促进淋巴内皮细胞成管,在体内能够诱导小鼠角膜淋巴管新生。5.Western blot实验证实了SEMA4C shRNA慢病毒的基因沉默效应。酶联免疫实验检测发现SEMA4C敲除HLEC中IL-8的水平显著低于对照组。SEMA4C敲除HLEC条件培养基组穿过Transwell膜的肿瘤细胞的数目显著少于对照组。激光共聚焦显微镜检测发现SEMA4C敲除组的肿瘤细胞相比对照组细胞骨架发生了明显的改变,肌动蛋白网络发生重排,肌动蛋白聚集于细胞边缘,形成扁平的边缘绉褶。SEMA4C在大多数肿瘤细胞中的丰度比永生化的细胞系高。它的表达水平在乳腺癌和前列腺癌细胞系中与肿瘤的转移潜力成正比。在组织水平上,SEMA4C的表达模式因组织类型的不同而有差异,相对同一组织类型的正常组织,SEMA4C在黑色素瘤、乳腺癌和卵巢癌癌组织的阳性率更高。小鼠角膜微袋模型为从体内水平研究血管生成和淋巴管新生提供了一个研究的良好工具,人重组SEMA4C融合蛋白在体外能够促进淋巴内皮细胞成管,在体内能够诱导小鼠角膜淋巴管新生。SEMA4C shRNA慢病毒能够稳定有效地干扰肿瘤细胞和淋巴内皮细胞SEMA4C的表达,SEMA4C能够调节淋巴内皮细胞细胞因子的分泌同时影响肿瘤细胞向淋巴内皮细胞的运动,并对肿瘤细胞的细胞骨架有明显的影响。总之,表达在肿瘤微环境中的肿瘤细胞和淋巴内皮细胞上的SEMA4C能够协同地发挥作用,通调节肿瘤微环境中肿瘤细胞与淋巴内皮细胞的交互作用促进肿瘤的淋巴转移。

全文目录

第一部分 SEMA4C调节肿瘤微环境中肿瘤细胞和淋巴内皮细胞的交互作用促进肿瘤淋巴转移  5-63
  中文摘要  5-10
  英文摘要  10-15
  一、淋巴管转移相关基因SEMA4C在多个肿瘤细胞系的表达情况及其在组织芯片表达的验证  15-33
    摘要  15-17
    前言  17-18
    材料和方法  18-25
    结果  25-29
    讨论  29-30
    参考文献  30-33
  二、利用小鼠角膜模型验证淋巴转移相关基因SEMA4C对淋巴管新生的作用  33-45
    摘要  33-35
    前言  35-36
    材料与方法  36-41
    结果  41-42
    讨论  42-43
    参考文献  43-45
  三、SEMA4C调节肿瘤微环境中肿瘤细胞和淋巴内皮细胞的交互作用  45-63
    摘要  45-47
    前言  47-48
    材料与方法  48-53
    结果  53-59
    讨论  59-61
    参考文献  61-63
第二部分利用公共SAGE数据库鉴定乳腺组织中肿瘤转移相关基因的差异表达情况  63-79
  摘要  63-64
  前言  64
  材料与方法  64-66
  结果  66-71
  讨论  71-74
  参考文献  74-79
综述淋巴转移相关基因SEMA4C研究进展  79-97
致谢  97-98

SEMA4C调节肿瘤微环境中肿瘤细胞和淋巴内皮细胞的交互作用促进肿瘤淋巴转移

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