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手足口病新型疫苗的初步研究

作　者: 李晓楠
导　师: 李培锋；王希良
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 手足口病 EV71病毒 CA16病毒 重组蛋白疫苗 VLPs疫苗 体液免疫 细胞免疫 粘膜免疫
分类号: R186
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的一种病毒性疾病,主要病原体为新肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇A16型(Coxsackie A16,CA16),EV71感染常常引发严重的中枢神经系统疾病并发症,CA16是引起心肌炎和心包炎等疾病的主要病原体。目前尚无有效治疗HFMD的药物,疫苗成为防控HFMD暴发最有效的手段之一,因此,研发安全、有效的HFMD疫苗势在必行。本文采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆EV71(中国安徽阜阳株Genbank----FJ607337)VP1和CA16(中国山东株Genbank----GQ253390)VP1基因,构建重组pFastBac HT A-EV71 VP1、pFastBac HT A-CA16 VP1和pFastBac HT B-Mel-EV71 VP1-CA16 VP1质粒,将各重组质粒转化至感受态细胞(DH10),获得各重组Bacmid DNA转染至昆虫细胞(Sf9),应用杆状病毒昆虫表达系统(Bacterium to Baculovirus,Bac-to-Bac)表达或分泌表达各重组蛋白,采用Ni2+离子亲和层析柱纯化各重组病毒表达产物;依据昆虫细胞偏爱密码子优化EV71 P1和EV71 3CD基因克隆至表达载体pFastBac Dual多角体蛋白启动子pPh和pP10上,构建重组pFastBac Dual EV71 P1-3CD质粒,将重组质粒与Bacmid同源重组,转染至Sf9,在Bac-to-Bac系统中利用病毒编码蛋白酶3CD切割核衣壳病毒结构蛋白P1,组装并用蔗糖密度梯度离心纯化EV71病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLPs);经免疫细胞化学法证实各目的蛋白在Sf9中的表达;将制备的重组单价蛋白疫苗,腹腔、滴鼻免疫Balb/c小鼠,检测免疫应答水平,取得如下结果:1.所克隆的各DNA片段均与Genbank中的相应DNA序列一致,重组EV71 VP1、CA16 VP1蛋白在Sf9中均获得表达,得到纯化重组蛋白浓度分别为0.318mg/mL和0.412mg/mL,纯度均>90%。2.重组EV71 VP1和CA16 VP1单价蛋白最佳抗原免疫剂量均为20μg;腹腔注射组中,小鼠血清特异性IgG抗体效价分别为875.43和1588.95,中和抗体效价分别为282.84和250.00,抗体亚型分布均以IgG1和IgG2b为主;CD4+/CD8+比值与对照组差异显著(P<0.05),小鼠T淋巴细胞增殖能力增强,脾细胞IL-4分泌数量>IFN-γ分泌数量(P<0.05);鼻腔和小肠灌洗液sIgA抗体与PBS组差异不显著(p>0.05);重组单价蛋白疫苗均可激发一定水平的体液免疫和细胞免疫,不能诱导粘膜免疫应答,以体液免疫应答为主。3.滴鼻免疫EV71 VP1组和CA16 VP1组血清IgG效价分别为278.54和211.66,鼻腔灌洗液sIgA抗体分别为64.31和54.22,小肠灌洗液sIgA抗体分别为15.98和13.55,脾细胞中sIgA-ASCs数量增多,重组单价蛋白疫苗可诱导体液免疫应答和一定水平的粘膜免疫应答。4.利用Bac-to-Bac系统分泌表达了EV71 VP1-CA16 VP1融合蛋白,得到纯化重组蛋白浓度为0.516mg/mL,纯度>90%。5.经昆虫密码子优化的EV71 P1和EV71 3CD基因,利用Bac-to-Bac系统成功组装了EV71 VLPs,纯化了EV71 VLPs的浓度为0.817mg/mL,纯度>90%。结论:制备了重组EV71 VP1和CA16 VP1单价蛋白疫苗,在它们免疫的小鼠模型中,免疫两次均能够产生较好的体液免疫应答,也能产生一定的细胞免疫和粘膜免疫应答;构建、表达和纯化了重组EV71 VP1-CA16 VP1二价融合蛋白和EV71 VLPs。因此,本实验结果为HFMD疫苗的深入研究奠定了基础。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-17
1 引言  17-33
  1.1 HFMD 的流行病学  17-18
  1.2 EV71 和CA16 分子生物学性质  18-19
    1.2.1 EV71 和CA16 病毒一般性状  18
    1.2.2 EV71 和 CA16 病毒基因组结构及编码蛋白  18-19
  1.3 EV71 和CA16 病毒增殖过程  19
    1.3.1 病毒的吸附和脱壳  19
    1.3.2 病毒的蛋白加工与 RNA 合成  19
    1.3.3 病毒颗粒组装与释放  19
  1.4 EV71 和CA16 病毒结构及其病原学特征  19-20
  1.5 HFMD 的致病机理  20-22
  1.6 微生物学诊断  22
    1.6.1 病毒分离及鉴定  22
    1.6.2 血清学实验方法诊断  22
    1.6.3 RT-PCR、核酸杂交技术  22
  1.7 HFMD 的药物治疗  22-23
    1.7.1 免疫球蛋白  22-23
    1.7.2 抗病毒药物  23
  1.8 预防疫苗研究概况  23-26
    1.8.1 灭活全病毒疫苗  23
    1.8.2 减毒疫苗  23-24
    1.8.3 重组蛋白疫苗  24
    1.8.4 载体疫苗  24
    1.8.5 核酸疫苗  24-25
    1.8.6 转基因植物、动物疫苗  25-26
    1.8.7 病毒样颗粒疫苗  26
  1.9 杆状病毒表达载体  26-32
    1.9.1 杆状病毒生物学特性  26-27
    1.9.2 杆状病毒表达系统的特点  27-29
    1.9.3 杆状病毒昆虫表达系统的组成  29-30
    1.9.4 杆状病毒昆虫表达系统的基本原理  30-31
    1.9.5 杆状病毒昆虫表达系统技术路线  31-32
  1.10 本研究的目的意义  32-33
2 重组 EV71 VP1 和 CA16 VP1 蛋白疫苗的构建、表达和纯化  33-59
  2.1 实验材料  33-36
    2.1.1 质粒、毒株和细胞  33
    2.1.2 分子生物学实验常用试剂  33-34
    2.1.3 主要仪器  34
    2.1.4 主要溶液配制  34-35
    2.1.5 分子生物学分析软件  35-36
    2.1.6 实验动物  36
  2.2 方法  36-51
    2.2.1 肠道病毒 EV71 和 CA16 的培养和分离  36-37
    2.2.2 提取 EV71 RNA 和 CA16 RNA  37
    2.2.3 EV71 和CA16 的RT-PCR  37
    2.2.4 引物设计与合成  37-38
    2.2.5 PCR 产物与酶切产物电泳及回收  38-41
    2.2.6 重组表达载体的构建  41-42
    2.2.7 连接产物的转化  42
    2.2.8 重组质粒的鉴定  42-43
    2.2.9 阳性质粒同源重组  43-45
    2.2.10 昆虫细胞 Sf9 培养  45-47
    2.2.11 昆虫细胞 Sf9 转染  47
    2.2.12 收获重组杆状病毒  47-48
    2.2.13 PCR 鉴定重组杆状病毒  48
    2.2.14 空斑试验测定病毒效价  48-49
    2.2.15 重组杆状病毒的扩增  49
    2.2.16 重组蛋白的表达  49
    2.2.17 重组蛋白表达鉴定  49-50
    2.2.18 AKTA 纯化仪纯化目的蛋白  50-51
  2.3 结果  51-57
    2.3.1 Vero 细胞培养EV71 和CA16 病毒  51
    2.3.2 RT-PCR 扩增EV71 VP1 和CA16 VP1 基因  51-52
    2.3.3 目的片段与表达载体连接酶切鉴定  52
    2.3.4 同源重组质粒 PCR 鉴定  52-53
    2.3.5 分析重组 EV71 VP1 Bacmid DNA 和 CA16 VP1 Bacmid DNA  53
    2.3.6 重组杆粒转染昆虫细胞 Sf9  53-55
    2.3.7 重组杆状病毒空斑试验  55
    2.3.8 重组蛋白表达检测  55-56
    2.3.9 Ni~(2+)亲和层析纯化表达蛋白  56-57
  2.4 小结与讨论  57-59
3 重组 EV71 VP1 和 CA16 VP1 单价蛋白疫苗免疫效果的评价  59-84
  3.1 材料  59-60
    3.1.1 毒株、细胞和实验动物  59
    3.1.2 免疫学实验试剂  59
    3.1.3 主要仪器  59-60
    3.1.4 主要试剂配制  60
  3.2 方法  60-65
    3.2.1 肠道病毒 EV71 和 CA16 培养  60
    3.2.2 EV71 和CA16 病毒滴度测定  60-61
    3.2.3 免疫方案  61
    3.2.4 检测抗原与佐剂吸附率  61
    3.2.5 标本采集  61-62
    3.2.6 小鼠血清 IgG 抗体及抗体亚型效价检测  62
    3.2.7 小鼠鼻腔、局部小肠灌洗液抗体效价检测  62
    3.2.8 小鼠血清中和抗体效价测定及病毒回滴  62-63
    3.2.9 脾淋巴细胞悬液的制备  63
    3.2.10 流式细胞分析检测  63-64
    3.2.11 T 淋巴细胞增殖检测  64
    3.2.12 检测特异性sIgA 抗体分泌细胞  64-65
    3.2.13 检测脾脏细胞分泌特异性 IFN-γ和 IL-4  65
    3.2.14 统计学方法  65
  3.3 结果  65-80
    3.3.1 EV71 和CA16 病毒滴度  65-66
    3.3.2 抗原与 AL(OH)3吸附率  66
    3.3.3 最佳抗原包被浓度的确定  66-67
    3.3.4 最佳免疫抗原剂量的确定  67-68
      3.3.4.1 不同抗原组腹腔免疫小鼠血清 IgG 抗体效价比较  67-68
      3.3.4.2 不同抗原组腹腔免疫小鼠血清中和抗体效价比较  68
    3.3.5 重组单价蛋白疫苗体液免疫应答观察  68-71
      3.3.5.1 血清特异性 IgG 抗体效价动态观察  68-69
      3.3.5.2 腹腔组不同部位 IgG 与sIgA 抗体比较  69-70
      3.3.5.3 滴鼻组不同部位 IgG 与sIgA 抗体的比较  70-71
    3.3.6 抗体亚型的检测  71
    3.3.7 血清特异性中和抗体效价动态观察  71-72
    3.3.8 重组单价蛋白疫苗滴鼻免疫小鼠粘膜免疫应答的观察  72-74
      3.3.8.1 ELISPOT 法检测sIgA 抗体分泌细胞方法的建立  72-73
      3.3.8.2 特异性sIgA 抗体分泌细胞的检测  73-74
    3.3.9 重组单价蛋白疫苗腹腔免疫小鼠细胞免疫应答的检测  74-80
      3.3.9.1 T 淋巴细胞增殖实验检测  74-75
      3.3.9.2 小鼠 T 淋巴细胞亚群流式细胞分析  75-76
      3.3.9.3 特异性 IFN-γ和IL-4 分泌型细胞方法的建立  76-78
      3.3.9.4 小鼠脾特异性 IFN-γ和 IL-4 分泌细胞的检测  78-80
    3.3.10 重组单价蛋白疫苗腹腔免疫后相关性分析  80
  3.4 小结与讨论  80-84
4 EV71 VP1 和CA16 VP1 二价融合蛋白疫苗的制备  84-95
  4.1 实验材料  84
  4.2 实验方法  84-88
    4.2.1 PCR 引物设计与合成  84
    4.2.2 EV71 VP1 基因的扩增  84
    4.2.3 EV71 VP1 PCR 产物双酶切及回收  84-85
    4.2.4 表达载体双酶切及回收  85
    4.2.5 EV71 VP1 基因与表达载体连接  85
    4.2.6 工程菌感受态制备、转化及 PCR 鉴定  85
    4.2.7 pFastBac HT B-EV71 VP1 质粒提取  85
    4.2.8 扩增 CA16 VP1 基因  85-86
    4.2.9 重组 pFastBac HT B-EV71 VP1 质粒与 CA16 VP1 PCR 产物双酶切、连接、转化及 PCR 鉴定  86
    4.2.10 重组质粒的获得  86
    4.2.11 DH10Bac 感受态的制备  86
    4.2.12 重组质粒的转化及 PCR 鉴定  86-87
    4.2.13 昆虫细胞 Sf9 贴壁(悬浮)培养  87
    4.2.14 重组质粒转染贴壁昆虫细胞 Sf9  87
    4.2.15 收获重组杆状病毒及提取杆状病毒 DNA PCR 鉴定  87
    4.2.16 空斑试验测定重组病毒效价  87
    4.2.17 重组二价融合蛋白表达的检测鉴定  87
    4.2.18 重组蛋白的 Western-blot 检测  87-88
    4.2.19 利用 AKTA 纯化仪纯化二价融合蛋白  88
  4.3 结果  88-92
    4.3.1 PCR 扩增EV71 VP1 及CA16 VP1 基因  88
    4.3.2 PCR 鉴定重组pFastBac HT B-EV71 VP1-CA16 VP1 质粒结果  88-89
    4.3.3 重组pFastBac HT B -EV71 VP1-CA16 VP1 质粒双酶切鉴定结果  89
    4.3.4 同源重组菌落 PCR 结果  89
    4.3.5 分析重组 EV71 VP1-CA16 VP1 Bacmid DNA 结果  89-90
    4.3.6 转染昆虫细胞 Sf9 的鉴定  90-91
    4.3.7 重组 EV71 VP1-CA16 VP1 杆状病毒空斑试验结果  91-92
    4.3.8 EV71 VP1-CA16 VP1 蛋白在昆虫细胞Sf9 表达的鉴定  92
  4.4 小结与讨论  92-95
5 EV71 病毒样颗粒疫苗的制备  95-107
  5.1 实验材料  95
  5.2 实验方法  95-99
    5.2.1 PCR 引物设计与合成  95
    5.2.2 扩增 EV71 P1 基因  95
    5.2.3 EV71 P1 基因PCR 产物双酶切及回收  95-96
    5.2.4 重组pFastBac Dual 质粒、EV71 P1 基因双酶切及回收  96
    5.2.5 EV71 P1 基因与供体质粒pFastBac Dual 连接  96
    5.2.6 感受态制备、重组pFastBac Dual-EV71 P1 质粒转化及 PCR 鉴定  96
    5.2.7 重组pFastBac Dual-EV71 P1 质粒的提取  96
    5.2.8 扩增 EV71 3CD 基因  96
    5.2.9 重组 pFastBac Dual-EV71 P1 质粒与 EV71 3CD 基因双酶切及回收  96-97
    5.2.10 重组 pFastBac Dual-EV71 P1 质粒与 EV71 3CD 基因连接、转化及 PCR 鉴定  97
    5.2.11 重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒的提取  97
    5.2.12 DH10 Bac 感受的制备  97
    5.2.13 重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒的转化  97-98
    5.2.14 pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒与Bacmid 同源重组及PCR 鉴定  98
    5.2.15 分离重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA  98
    5.2.16 分析重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD Bacmid DNA  98
    5.2.17 昆虫细胞 Sf9 贴壁(悬浮)培养  98-99
    5.2.18 重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA 质粒转染昆虫细胞Sf9  99
    5.2.19 收获重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒及 PCR 鉴定  99
    5.2.20 空斑试验测定重组 Bac-EV71 P1-3CD 病毒效价及重组杆状病毒的扩增  99
    5.2.21 重组 Bac-EV71 P1-3CD 蛋白在昆虫细胞 Sf9 表达的检测鉴定  99
    5.2.22 蔗糖密度梯度离心法纯化 EV71 VLPs  99
      5.2.22.1 蔗糖浓度的摸索  99
      5.2.22.2 EV71 VLPs 的初步纯化  99
  5.3 结果  99-105
    5.3.1 PCR 扩增EV71 P1 和EV71 3CD 基因  99-100
    5.3.2 重组质粒的构建及双酶切鉴定  100-101
    5.3.3 同源重组质粒 PCR 鉴定  101
    5.3.4 分析重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA  101-102
    5.3.5 重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA 转染昆虫细胞Sf9  102
    5.3.6 重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒 DNA PCR 鉴定  102-103
    5.3.7 重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒空斑试验  103
    5.3.8 IFA 检测重组EV71 P1-3CD 蛋白  103-104
    5.3.9 蔗糖密度梯度离心法纯化 EV71 VLPs  104
    5.3.10 EV71 VLPs 的SDS-PAGE 分析及Western blot 检测  104-105
    5.3.11 透射电镜观察 EV71 VLPs 形成  105
  5.4 小结与讨论  105-107
6 全文总结  107-110
  6.1 制备 HFMD 新型疫苗  107
    6.1.1 单价重组蛋白疫苗的制备  107
    6.1.2 二价重组融合蛋白疫苗的制备  107
    6.1.3 EV71 VLPs 疫苗的制备  107
  6.2 重组单价蛋白疫苗免疫效果的评价  107-109
    6.2.1 重组单价蛋白疫苗体液免疫应答的评价  107-108
    6.2.2 重组单价蛋白疫苗细胞免疫应答的评价  108
    6.2.3 重组蛋白疫苗粘膜免疫应答的评价  108-109
  6.3 结论  109-110
致谢  110-111
参考文献  111-118
作者简介  118

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