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肠道病毒71型VP1蛋白粘膜免疫效果研究

作　者: 张福顺
导　师: 李德新
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 免疫学
关键词: EV71病毒粘膜免疫疫苗 VP1蛋白
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

手足口病(Hand-Foot-Mouth Disease, HFMD)又名发疹性水泡口腔炎,引起HFMD的病原体主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组的2、4、5、7、9、10、16型,柯萨奇病毒B组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为科萨奇病毒A组16型(CA16)及肠道病毒71型。临床表现以发热和手、足、口腔和臀部等部位出现皮疹为主要临床特征的一种急性传染病。绝大多数HFMD患者预后良好,一般可在5-7天痊愈,属于自限性疾病。病毒还可侵犯呼吸系统、中枢神经系统、心血管系统等引起脑炎、心肌炎、肺水肿、迟缓性麻痹等症状,个别危重患儿可因多种原因导致死亡。该病全年均可发病,好发于夏秋季,常见于5岁以下儿童。重症HFMD主要由EV71引起。HFMD的主要传播途径是粪-口途径,亦可通过呼吸道传播。HFMD传染性强,易导致流行或暴发。近年来手足口病的流行态势严峻,加大了人们对HFMD主要病原体EV7的关注。由于目前对HFMD尚无特效的治疗药物,因此疫苗研发成为当务之急。EV71主要通过粪-口途径或以气溶胶形式传播,通过粘膜疫苗进行免疫是合乎逻辑的。开发EV71粘膜疫苗与传统的注射疫苗相比具有安全,经济和易于大规模人群接种等诸多优点,因此引起越来越多研究者的关注。本研究工作共包括三部分：第一部分：EV71病毒的纯化及VP1蛋白的原核表达与纯化根据近年的流行病学资料,目前我国大陆流行的EV71为C4亚型,所以本研究选取C4亚型HN-8分离株作为研究对象,并对其基因序列进行比对分析,确认其主要的中和表位：PDSRESLAWQTATNP和YPTFGEHKQEKDLEY没有发生氨基酸水平上的改变。提取病毒RNA,通过反转录获得病毒基因组的cDNA,体外扩增病毒的VP1基因序列,并将其克隆入pET30a载体,得到pET30a-VP1质粒。通过IPTG诱导VP1蛋白的表达,并且纯化出VP1蛋白,每升菌液的蛋白产量可达30-40mg。通过SDS-PAGE、Western blot对纯化出的VP1蛋白进行分析。本部分还对HN-8分离株进行了Vero细胞培养,病毒的滴定和纯化。通过连续传代病毒滴度可达108TCID50。并且得到了较纯的病毒颗粒。第二部分：VP1蛋白昆虫细胞表达载体的构建及纯化。以pET30a-VP1质粒为基因序列来源,扩增VP1基因序列,将其克隆至pAcGP67-B载体,酶切鉴定后,将正确的克隆测序,选取VPl基因序列没有发生碱基改变的克隆与杆状病毒线性化DNA共转染SF9细胞,通过连续传代不断增强杆状病毒的毒力。通过间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blot对SF9细胞表达的VP1蛋白进行了检测。为了用捕获法检测小鼠血清中的IgM,本部分还对VP1蛋白同辣根过氧化酶进行了偶联,并对酶标的VP1蛋白工作浓度进行测定。当抗IgM的μ链捕获抗体包被浓度为200ng时,HRP-VP1最佳工作浓度为1：160。第三部分：原核表达VP1蛋白的粘膜免疫学效果的研究原核表达的VP1亚单位疫苗需要佐剂的辅助,才能高效诱导小鼠的体液免疫应答。本部分将原核表达的基因工程重组VP1蛋白与粘膜佐剂壳聚糖进行配伍构成疫苗,以雌性Balb/C小鼠为动物模型,通过灌胃途径进行免疫。VP1蛋白粘膜免疫设计了100μg和1000μg两个剂量组,并且设立了阳性对照组：灭活EV71全病毒与壳聚糖配伍组(粘膜途径免疫)；灭活EV71全病毒与氢氧化铝配伍组和VPl蛋白与氢氧化铝配伍组(肌注途径免疫)。阴性对照组：PBS与壳聚糖和氢氧化铝分别配伍。进行0天、7天、28天三针免疫。本部分完成了原核VP1蛋白高、低剂量组的粘膜免疫及其与阳性对照组和肌注组免疫效果的比较。发现VP1蛋白与壳聚糖配伍免疫Balb/C小鼠后,不仅可以诱导小鼠血清中特异性IgM和IgG抗体反应,还可以诱导小鼠肠道、阴道和呼吸道粘膜表面较强和较持久的特异性sIgA应答反应。本实验还对小鼠脾中IFN-γ分泌细胞进行了计数,发现粘膜免疫组的IFN-γ分泌Th1型细胞数明显高于阴性对照组。体外中和实验显示：VPl蛋白高剂量粘膜免疫组血清中和滴度可达1：16左右。初步证明了VP1蛋白的粘膜免疫效果。本研究以原核表达VPl蛋白与壳聚糖配伍后为疫苗研究模型,通过灌胃途径对小鼠进行粘膜免疫,初步阐明了在壳聚糖佐剂的辅助下,VP1蛋白可以诱导产生特异性的体液和细胞免疫应答,为EV71病毒粘膜疫苗研究提供了理论基础和方法。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-16
第一部分 EV71病毒的纯化及VP1蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达  16-45
  引言  16-18
  实验材料  18-21
  实验方法  21-36
  实验结果  36-41
  讨论  41-42
  参考文献  42-44
  小结  44-45
第二部分 VP1蛋白在杆状病毒表达系统中的表达  45-67
  引言  45-46
  实验材料  46-48
  实验方法  48-58
  实验结果  58-64
  讨论  64-65
  参考文献  65-66
  小结  66-67
第三部分原核表达VP1蛋白的粘膜免疫学效果研究  67-95
  引言  67-68
  实验材料  68-70
  实验方法  70-76
  实验结果  76-89
  讨论  89-92
  参考文献  92-94
  小结  94-95
全文总结及展望  95-97
综述  97-104
  参考文献  101-104
致谢  104

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