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两种特异的柴胡皂苷酶和薯蓣皂苷酶特性的研究

作　者: 富瑶瑶
导　师: 金凤燮
学　校: 延边大学
专　业: 有机化学
关键词: 柴胡皂苷酶薯蓣皂苷酶酶纯化酶水解柴胡皂苷薯蓣皂苷
分类号: Q946.49
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

苷类是中草药的有效成分之一。但天然苷类物质并不是生理活性最佳的分子结构,皂苷口服后在体内经过肠道菌和消化系统酶的作用,转化为低糖基、次生苷被吸收而起药效。本文目的是利用生物酶法在体外将天然皂苷转化成易吸收、药效高的结构。为了得到高活性、易吸收的低糖基的柴胡皂苷及薯蓣皂苷,本文从微生物中获得了与传统糖苷酶性质不同的新型皂苷酶,并对新型柴胡皂苷酶和薯蓣皂苷酶进行了分离纯化、酶学性质、酶催化水解作用,及定向转化的研究。采用缓冲液抽提、硫铵沉淀、离子交换层析、凝胶电泳法从两种微生物Aspergillus oryzae c42和Absidia sp. d38中分别分离纯化了柴胡皂苷酶及薯蓣皂苷酶。柴胡皂苷酶被纯化了56倍,收率为1.4%；薯蓣皂苷酶被纯化了7.8倍,收率为3.6%。柴胡皂苷酶最适反应温度为40℃,最适pH为5.0；Cu++,Hg++,Ag+对酶活力有抑制作用,Ca++和Mg++对酶活力有激活作用。该酶在60℃以下、pH 4.0～7.0相对稳定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定该单亚基酶分子量约为58 kDa。薯蓣皂苷酶最适反应温度为40℃,最适pH为5.0；Cu++,Hg++对酶活力有抑制作用；Mg2+对酶活力有激活作用。该酶在50℃以下、pH 5.0～6.0相对稳定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定该单亚基酶分子量约为55 kDa。在柴胡皂苷酶的研究中发现,柴胡皂苷酶可以水解柴胡皂苷A(含有环氧醚键)和柴胡皂苷B2(不含环氧醚键)。首先将柴胡皂苷的3-O-β-D-(1→3)-Glc水解,形成3-O-β-D-Fuc-柴胡皂苷元,然后进一步水解3-O-β-D-Fuc-柴胡皂苷元的3-O-β-D-Fuc形成不带糖基的柴胡皂苷元。柴胡皂苷酶对糖基位置及苷元结构的选择性高,能较好的水解三萜类皂苷(柴胡皂苷),对糖基种类选择性低,可以水解3-C位的Glc、Fuc等不同种类糖基；对甾体类皂苷(薯蓣皂苷)不水解。在薯蓣皂苷酶的研究中发现,薯蓣皂苷酶首先将薯蓣皂苷的两个3-O-α-L-(1→4)-Rha和3-O-α-L-(1→2)-Rha水解,生成3-O-β-Glc-薯蓣皂苷元,然后进一步水解3-O-β-D-Glc-薯蓣皂苷元的3-O-β-D-Glc生成不带糖基的薯蓣皂苷元。薯蓣皂苷酶还能将3-O-[α-L-(1→4)-Ara,α-L-(1→2)-Rha]-β-D-Glc-薯蓣皂苷元的3-O-α-L-(1→2)-Rha水解,生成3-O-α-L-Ara-β-D-Glc-薯蓣皂苷元,然后进一步水解α-L-(1→4)-Ara生成3-O-β-D-Glc-薯蓣皂苷元,最后水解3-O-β-D-Glc生成不带糖基的薯蓣皂苷元。薯蓣皂苷酶仅对甾体类皂苷(薯蓣皂苷、3-O-[α-L-(1→4)-Ara,α-L-(1→2)-Rha]-β-D-Glc-薯蓣皂苷元)具有较好的水解作用,对三萜类皂苷(柴胡皂苷、白头翁皂苷及朱砂根皂苷)不具有水解作用。该酶糖基种类的选择性不高,可以水解Glc、Ara、Rha等不同种类糖基,但对糖基位置苷元种类具有较高的选择性,只能水解甾醇类皂苷。定向转化柴胡皂苷时,柴胡皂苷酶在底物浓度20 mg／mL,40℃,pH 5.0条件下,反应24h水解20g柴胡皂苷得粗产物23.78g。柴胡皂苷酶经60%回收后仍具有很高的酶活力,其转化率大于60%。酶解产物经硅胶柱层析法分离纯化后,回收率为79.55%,水解掉两个糖基的柴胡皂苷单体(酶解产物Ⅰ)得率为21.85%,水解掉一个糖基的柴胡皂苷单体(酶解产物Ⅱ)得率为4.45%。经HPLC测定纯度达90%左右。定向转化薯蓣皂苷时,薯蓣皂苷酶在底物浓度15 mg／mL,40℃,pH 5.0条件下,反应30h水解20g薯蓣皂苷得粗产物22.54g。薯蓣皂苷酶经60%回收后仍具有很高的酶活力,其转化率大于60%。酶解产物经硅胶柱层析法分离纯化后,回收率为91.8%,薯蓣皂苷元单体得率为20.85%,3-O-β-D-Glc-薯蓣皂苷元单体得率为39.8%；3-O-α-L-Rha-β-D-Glc-薯蓣皂苷元单体得率为12.85%。经HPLC测定纯度达90%左右。柴胡皂苷酶和薯蓣皂苷酶对糖基位置及苷元结构的选择性高,柴胡皂苷酶不水解薯蓣皂苷、薯蓣皂苷酶不水解柴胡皂苷；两种酶对糖基种类的选择性低、能够水解多种糖基；这不同于国际酶学委员会认定的“一种糖昔酶只能水解一种糖苷键”的规律；柴胡皂苷酶和薯蓣皂苷酶是新发现的特异酶。本文在证明酶法定向转化柴胡皂苷及薯蓣皂苷制备低糖基皂苷或苷元的可行性的同时,为深入研究糖苷酶由其是皂苷糖苷酶奠定了一定的实验基础。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章文献综述  14-42
  1.1 皂苷的研究进展  14-21
    1.1.1 皂苷的分类及结构  14-18
      1.1.1.1 三萜皂苷  14-16
      1.1.1.2 甾体皂苷  16-18
    1.1.2 皂苷侧链糖基与其生物活性  18-19
    1.1.3 改变皂苷糖基提高其活性的研究进展  19-21
      1.1.3.1 化学法  19-20
      1.1.3.2.酶法  20-21
  1.2 糖苷酶的研究进展  21-25
    1.2.1 酶的分类与命名  21-22
    1.2.2 糖苷酶的催化机理  22
    1.2.3 皂苷糖苷酶(皂苷酶)的生物催化  22-23
    1.2.4 糖苷酶的研究方法  23-25
      1.2.4.1 酶的分离提纯方法  23-24
      1.2.4.2 酶的分析方法  24-25
      1.2.4.3 酶性质的研究方法  25
  1.3 柴胡的研究进展  25-35
    1.3.1 柴胡植物  25-28
      1.3.1.1 柴胡种类及形态  26-27
      1.3.1.2 柴胡的主要化学成分  27-28
      1.3.1.3 柴胡的应用  28
    1.3.2 柴胡皂苷  28-35
      1.3.2.1 柴胡皂苷的结构  28-32
      1.3.2.2 柴胡皂昔研究现状  32-33
      1.3.2.3 柴胡皂苷的药理作用  33-35
  1.4 薯蓣植物的研究进展  35-40
    1.4.1 天然资源  35-36
    1.4.2 薯蓣属植物的主要化学成分  36-37
    1.4.3 薯蓣皂苷的研究现状  37-38
    1.4.4 薯蓣皂苷元的工业生产现状  38-39
    1.4.5 薯蓣皂苷的药理作用  39-40
  1.5 本论文的研究内容  40-42
第二章柴胡皂苷酶及薯蓣皂苷酶的分离纯化  42-55
  2.1 引言  42-44
  2.2 材料与方法  44-46
    2.2.1 实验材料  44
    2.2.2 实验方法  44-46
      2.2.2.1 粗酶的提取  44
      2.2.2.2 硫铵沉淀  44
      2.2.2.3 离子交换层析  44
      2.2.2.4 酶活力的测定  44-45
      2.2.2.5 Folin-酚法测定蛋白质含量  45
      2.2.2.6 酶蛋白纯度的测定  45-46
  2.3 结果与讨论  46-53
    2.3.1 柴胡皂苷酶的分离纯化  46-50
      2.3.1.1 微生物发酵时间对柴胡皂苷酶活力的影响  46
      2.3.1.2 硫铵沉淀分离纯化柴胡皂苷酶  46-47
      2.3.1.3 离子交换层析分离纯化柴胡皂苷酶  47-49
      2.3.1.4 柴胡皂苷酶纯度的鉴定  49-50
    2.3.2 薯蓣皂苷酶的分离纯化  50-53
      2.3.2.1 微生物发酵时间对薯蓣皂苷酶活力的影响  50
      2.3.2.2 硫铵沉淀分离纯化薯蓣皂苷酶  50
      2.3.2.3 离子交换层析分离纯化薯蓣皂苷酶  50-52
      2.3.2.4 薯蓣皂苷酶纯度的鉴定  52-53
  2.4 小结  53-55
第三章柴胡皂苷酶及薯蓣皂苷酶的性质  55-66
  3.1 引言  55
  3.2 材料与方法  55-56
    3.2.1 实验材料  55
    3.2.2 实验方法  55-56
      3.2.2.1 酶活力的测定  55
      3.2.2.2 酶分子量的测定  55-56
      3.2.2.3 酶催化最适温度的测定  56
      3.2.2.4 酶温度稳定性的测定  56
      3.2.2.5 酶催化最适pH的测定  56
      3.2.2.6 酶pH稳定性的测定  56
      3.2.2.7 金属离子对酶活力影响  56
  3.3 结果与讨论  56-65
    3.3.1 柴胡皂苷酶的部分性质  56-61
      3.3.1.1 酶的分子量  57-58
      3.3.1.2 酶反应最适温度  58-59
      3.3.1.3 温度稳定性  59
      3.3.1.4 酶反应最适pH  59-60
      3.3.1.5 pH稳定性  60
      3.3.1.6 金属离子对酶活力的影响  60-61
    3.3.2 薯蓣皂苷酶的部分性质  61-65
      3.3.2.1 酶的分子量  61-62
      3.3.2.2 酶反应最适温度  62-63
      3.3.2.3 温度(热)稳定性  63
      3.3.2.4 酶反应最适pH  63-64
      3.3.2.5 pH稳定性  64
      3.3.2.6 金属离子对酶活力的影响  64-65
  3.4 小结  65-66
第四章柴胡皂苷酶及薯蓣皂苷酶的催化作用  66-74
  4.1 引言  66
  4.2 材料与方法  66-67
    4.2.1 实验材料  66
    4.2.2 实验方法  66-67
      4.2.2.1 酶活力的测定  66-67
      4.2.2.2 反应产物的测定  67
  4.3 结果与讨论  67-73
    4.3.1 柴胡皂苷酶的催化作用  67-70
      4.3.1.1 柴胡皂苷酶催化水解柴胡皂苷  67-69
      4.3.1.2 柴胡皂苷酶催化水解其它皂苷  69-70
    4.3.2 薯蓣皂苷酶的催化作用  70-73
      4.3.2.1 薯蓣皂苷酶催化水解薯蓣皂苷  70-72
      4.3.2.2 薯蓣皂苷酶催化水解其他皂苷  72-73
  4.4 小结  73-74
第五章酶法水解柴胡皂苷制备低糖基柴胡皂苷及苷元  74-85
  5.1 引言  74
  5.2 材料与方法  74-76
    5.2.1 实验材料  74-75
    5.2.2 实验方法  75-76
      5.2.2.1 柴胡皂苷酶的制备  75
      5.2.2.2 柴胡皂苷的酶解  75
      5.2.2.3 酶解产物的分离  75-76
      5.2.2.4 反应产物的测定  76
  5.3 结果与讨论  76-83
    5.3.1 酶液的大量制备  76
    5.3.2 酶水解柴胡皂苷反应条件的确定  76-78
      5.3.2.1 底物溶液的配制  76-77
      5.3.2.2 酶反应温度、pH的确定  77
      5.3.2.3 酶反应时间的确定  77-78
      5.3.2.4 酶反应底物浓度的确定  78
    5.3.3 柴胡皂苷的水解  78-80
    5.3.4 酶解产物的分离纯化  80-82
    5.3.5 酶解产物纯度的测定  82-83
  5.4 小结  83-85
第六章酶法水解薯蓣皂苷制备低糖基薯蓣皂苷及苷元  85-96
  6.1 引言  85
  6.2 材料与方法  85-87
    6.2.1 实验材料  85-86
    6.2.2 实验方法  86-87
      6.2.2.1 薯蓣皂苷酶的制备  86
      6.2.2.2 薯蓣皂苷的酶解  86
      6.2.2.3 酶解产物的分离  86-87
      6.2.2.4 反应产物的测定  87
  6.3 结果与讨论  87-95
    6.3.1 酶液的大量制备  87
    6.3.2 酶水解薯蓣皂苷反应条件的确定  87-89
      6.3.2.1 底物溶液的配制  87-88
      6.3.2.2 酶反应温度、pH的确定  88
      6.3.2.3 酶反应时间的确定  88-89
      6.3.2.4 酶反应底物浓度的确定  89
    6.3.3 薯蓣皂苷的水解  89-91
    6.3.4 酶解产物的分离纯化  91-92
    6.3.5 酶解产物纯度的测定  92-95
  6.4 小结  95-96
第七章结论  96-99
  7.1 结论  96-98
  7.2 创新点  98
  7.3 展望  98-99
参考文献  99-110
致谢  110-111
攻读博士期间发表的论文  111-112
攻读博士期间参与出版的书籍  112

两种特异的柴胡皂苷酶和薯蓣皂苷酶特性的研究

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