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脱落乳牙干细胞骨向分化相关分子Runx2动态表达研究

作　者: 王立媛
导　师: 贾智
学　校: 天津医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 脱落乳牙干细胞骨向分化 Runx2 基因动态表达
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：体外分离、培养人脱落乳牙干细胞(SHEDs),分析其生物学特征,探讨SHEDs骨向分化潜能,分不同时间点观察成骨相关转录因子Runx2的动态表达规律,为研究SHEDs成骨调控因素及其组织再生临床应用提供研究基础。方法：依据Miura等的实验方法,选取6～10岁健康儿童因滞留拔除的乳牙,采用酶消化法分离、有限稀释法纯化,获得人脱落乳牙干细胞。观察原代和传代细胞生长、增殖情况,测定细胞克隆形成率,HE染色,观察原代及传代细胞形态学特征。流式细胞仪及细胞免疫荧光染色检测SHEDs表面标志。培养的第3代SHEDs,在体外经含有IBMX、胰岛素、消炎痛和氢化可的松条件培养液,向脂肪组织进行诱导分化,观察细胞形态变化及细胞内形成脂滴情况,4周后油红-O染色。第3代SHEDs,在含有10%胎牛血清、1×10-8mol/1地塞米松、50 mg/lβ-甘油磷酸钠和10mmol/1维生素C的成骨诱导条件培养液诱导3周,观察细胞形态和生长规律的变化,分别于成骨诱导第0天和第21天做茜素红染色,检测矿化结节形成情况,鉴定其成骨分化的生物学特征。于成骨诱导的第0、3、6、9、12、15、18和21天,用RT-PCR技术检测Runx2的动态表达。结果：1.通过酶消化法和有限稀释法获得了人脱落乳牙干细胞,原代培养的细胞一般在接种2天后,倒置显微镜下见细胞贴壁生长,形态呈现多形性。随着生长传代,细胞较多的出现多角形、梭形,成纤维细胞样,并且大小趋近一致。原代细胞爬片HE染色,大部分细胞呈梭形,体积较小,轮廓清晰,细胞核为圆形或卵圆形,体积较大。少数细胞内可见多个核仁存在。2.计算细胞克隆形成率为22-26个/103细胞。流式细胞仪和细胞免疫荧光染色检测细胞表面标志显示,CD146+占总细胞量的92.51±1.34%,STRO-1+占总细胞量的20.01±1.62%。在成脂诱导体系的的作用下,可见个别细胞胞浆内出现高强度的折射点,油红－O染色可见橙红色阳性颗粒。在矿化诱导液的作用下,细胞形态变为多角形,形成钙化结节,经茜素红色呈阳性。3.RT-PCR技术检测SHEDs成骨诱导过程中Runx2的动态表达规律显示：0天已有表达,0～6天成明显增强趋势,6～12天显著下降,12～18天表达再次上升,以后相对平稳。结论：1.SHEDs可体外分离、培养,表达间充质干细胞表面标志,具有较强的倍增能力及克隆形成能力,具有成脂和成骨向分化能力。2.Runx2在SHEDs成骨分化过程中成动态表达,成骨分化各阶段均有表达,早期和晚期表达上升,中期表达有下降趋势。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略词  10-12
前言  12-15
  研究现状、成果  12-14
  研究目的、方法  14-15
一、乳牙牙髓组织分离培养及其生物学特性  15-27
  1.1 材料和方法  15-19
    1.1.1 乳牙牙髓组织的获得  15
    1.1.2 实验试剂和设备  15-17
    1.1.3 细胞培养  17-18
    1.1.4 有限稀释法纯化脱落乳牙干细胞  18
    1.1.5 形态学观察  18
    1.1.6 细胞克隆形成率(colony forming unit,CFU)测定  18
    1.1.7 流式细胞仪细胞表面抗原检测仪  18
    1.1.8 细胞免疫荧光染色鉴定表面抗原  18-19
    1.1.9 成脂分化诱导实验  19
  1.2 结果  19-23
    1.2.1 倒置显微镜细胞形态学观察  20
    1.2.2 HE染色形态学观察  20
    1.2.3 人脱落乳牙干细胞克隆形成率(CFU)  20
    1.2.4 流式细胞仪表面抗原检测  20
    1.2.5 细胞免疫荧光染色结果  20
    1.2.6 成脂诱导分化后油红-O染色结果  20-23
      图表 1-1—1-6  21-22
      图表 1-7—1-8  22-23
  1.3 讨论  23-26
    1.3.1 人脱落乳牙干细胞体外培养技术  23-24
    1.3.2 细胞形态学观察  24
    1.3.3 克隆形成实验  24
    1.3.4 SHEDs的表面标志的测定和鉴定  24-26
  1.4 小结  26-27
二、人脱落乳牙干细胞体外成骨诱导及Runx2 动态表达研究  27-39
  2.1 材料和方法  27-31
    2.1.1 实验设备  27-28
    2.1.2 主要试剂  28
    2.1.3 人脱落乳牙干细胞的成骨诱导培养及观察  28
    2.1.4 矿化结节形成能力检测  28
    2.1.5 RT-PCR检测Runx2的表达  28-31
  2.2 结果  31-32
    2.2.1 细胞生长情况  31
    2.2.2 矿化结节形成能力  31
    2.2.3 PCR结果  31-32
  2.3 讨论  32-38
  2.4 小结  38-39
结论  39-40
参考文献  40-45
发表论文和参加科研情况说明  45-46
综述牙齿相关干细胞表型特征和成骨特性  46-60
  参考文献  55-60
致谢  60-61

脱落乳牙干细胞骨向分化相关分子Runx2动态表达研究

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