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尿液微量清蛋白检测方法的建立与评价

作　者: 向跃芸
导　师: 徐克前
学　校: 中南大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 尿液 微量清蛋白 聚偏氟乙烯 考马斯亮蓝R-250 体积排阻高效液相色谱法
分类号: R446.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的1.建立一种简单、灵敏、经济的以PVDF膜为载体的染料结合法(PVDF膜-染料结合法)测定尿液中的微量清蛋白。2.建立一种简单、快速的体积排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)测定尿液中的微量清蛋白。方法1. PVDF膜-染料结合法：于PVDF膜上先加甲醇,再加清蛋白标准品和待测尿液样本,用考马斯亮蓝染色液进行染色,脱色、干燥后膜上形成样本斑点。用凝胶成像系统进行斑点密度扫描,制作斑点密度-清蛋白标准品浓度标准曲线,再计算出待测尿样本中清蛋白的浓度。2. SE-HPLC法：清蛋白标准液或尿液样本200μL与0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)400μ漩涡混匀后,自动进样20μL分析测定；色谱柱为分子筛Agilent Zorbax GF-250柱(250mm×4.6mmi.d,4 um)；流动相：溶剂A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,溶剂B为乙腈,溶剂A与溶剂B体积比为85:15；流速为1.0 ml/min;柱温为30℃；检测波长为205nm；用外标法测定峰面积对尿液微量清蛋白进行定量分析。结果1. PVDF膜-染料结合法：批内和批间CV分别为9.1%和10.0%(50 mg/L)、5.6%和9.6%(100 mg/L)及5.0%和7.4%(200 mg/L)。对63例待检样本进行检测,免疫速率散射比浊法和PVDF膜-染料结合法的检测结果均值分别为179.30±187.01 mg/L和237.63±157.81mg/L,两法有良好的相关性(r2=0.8552),但PVDF膜-染料结合法结果高于免疫速率散射比浊法(P=0.000)。方法的检测低限为15mg/L,线性范围可达600 mg/L。Hb、胆红素、IgG对方法有正干扰。尿液pH值对结果无显著性影响。用PVDF膜比用醋酸纤维素膜检测尿中清蛋白有更高的灵敏度。2. SE-HPLC法：清蛋白保留时间约为1.73 min,批内和批间CV分别为3.98%和4.05%(20 mg/L)、3.55%和3.60%(200 mg/L)及4.65%和4.74%(2000 mg/L),平均回收率为99.2%。SE-HPLC法与免疫速率散射比浊法比较,其检测结果均值在正常清蛋白尿组分别为40.0±24.6 mg/L、8.4±4.3 mg/L(P=0.000；n=40),在微量清蛋白尿组分别为260.2±138.8 mg/L、57.9±37.3 mg/L(P=0.000；n=30),在蛋白尿组分别为1127.9±622.1 mg/L、1212.7±696.3 mg/L(P=0.001；n=30)。前两组SE-HPLC法检测结果明显高于免疫速率散射比浊法,而在蛋白尿组SE-HPLC法检测结果比免疫速率散射比浊法低约7%。SE-HPLC法的检测低限为2mg/L,2000 mg/L浓度范围内线性良好r2=0.9969)结论1.本研究建立了一种PVDF膜-染料结合法检测尿液微量清蛋白浓度,该方法精密度高,操作简便,成本低廉,灵敏度高,是一种经济简便的尿液清蛋白检测方法,适用于MAU的快速筛查。2.本研究建立了一种SE-HPLC法检测尿液微量清蛋白浓度,该方法精密度、准确度、回收率、检测低限、线性范围等指标均符合诊断试验的要求,尤其是流动相配制简单,清蛋白保留时间短,具有简单、快速、灵敏的特点,可以实现大批量的自动检测,适用于临床常规定量检测尿液微量清蛋白。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-12
英文缩略词表  12-13
第一部分 PVDF膜-染料结合法测定尿液微量清蛋白的建立与评价  13-31
  第一章 前言  13-17
  第二章 材料与方法  17-22
    2.1 样本收集及处理  17
    2.2 仪器与材料  17-18
    2.3 试剂  18
    2.4 实验方法  18-22
      2.4.1 应用试剂的配制  18-20
      2.4.2 空白样本  20
      2.4.3 干扰实验样本的制备  20
      2.4.4 操作步骤  20-21
      2.4.5 统计学分析  21-22
  第三章 结果  22-27
    3.1 样本检测图  22
    3.2 标准曲线的制作  22
    3.3 方法学评价  22-25
      3.3.1 精密度  22-23
      3.3.2 方法比较实验  23
      3.3.3 检测低限  23
      3.3.4 线性范围  23-25
      3.3.5 干扰实验  25
      3.3.6 尿液pH值的影响  25
    3.4 PVDF膜与醋酸纤维素膜的比较  25-27
  第四章 讨论  27-31
第二部分 体积排阻高效液相色谱法测定尿液微量清蛋白的建立与评价  31-46
  第一章 前言  31-33
  第二章 材料与方法  33-37
    2.1 样本收集及处理  33
    2.2 仪器  33-34
    2.3 试剂与材料  34
    2.4 实验方法  34-37
      2.4.1 应用试剂的配制  34-35
      2.4.2 空白样本  35
      2.4.3 色谱条件  35
      2.4.4 进样前样本处理  35
      2.4.5 尿液微量清蛋白的定量分析  35-36
      2.4.6 统计学分析  36-37
  第三章 结果  37-44
    3.1 色谱分离条件的优化  37
      3.1.1 流动相的选择  37
      3.1.2 检测波长的选择  37
      3.1.3 流速对分离效果的影响  37
      3.1.4 清蛋白保留时间的稳定性  37
    3.2 方法学评价  37-44
      3.2.1 空白样本、标准品和尿样本的色谱分离图  38-39
      3.2.2 标准曲线的制作  39-40
      3.2.3 精密度  40
      3.2.4 回收试验  40
      3.2.5 方法比较实验  40-41
      3.2.6 检测低限  41
      3.2.7 线性范围  41-44
  第四章 讨论  44-46
第三部分 结论  46-47
参考文献  47-54
综述  54-68
  参考文献  63-68
致谢  68-69
在读硕士期间的研究成果及发表的学术论文  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 生物化学检验、临床检验
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