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靶向23SrRNA domain Ⅱ区的多肽核酸（peptide nucleic acids, PNAs）抑制蛋白翻译和细菌生长的研究

作　者: 黄学文
导　师: 诸葛洪祥
学　校: 苏州大学
专　业: 病原生物学
关键词: 增强绿色荧光蛋白(EGFP) 重组载体体外翻译系统原核表达多肽核酸(PNA) 反义抑制 23SrRNA 肽
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目前细菌耐药性问题越来越严重,而新抗生素的研究却十分缓慢,即使有新抗生素出现,但很快就会有耐药菌株出现。这主要是因为,抗生素是微生物体内的天然或衍生物质,微生物体内同时也具有抵抗抗生素的耐药基因。因此,面对细菌耐药,包括反义抑制在内的许多征服微生物的努力都在研究中。反义抑制是微生物体内调节基因表达的基本方式。RNA包括mRNA和rRNA的功能区是反义调节最常见的进入靶位。运用反义寡核苷酸技术抑制翻译的尝试已显示出希望,但在序列特异性、生物稳定性、溶解性、细胞摄入等方面仍然存在问题。多肽核酸（PNA）是DNA类似物,生物性质稳定,不被核酸酶和蛋白酶消化降解。PNA肽骨架由（2-氨基乙基）甘氨酸聚合而成,呈电荷中性。因此PNA与DNA/RNA链间静电斥力小,PNA-DNA/RNA双螺旋比DNA-DNA的热稳定性高,PNA与DNA/RNA的结合具有高度序列特异性。嘌呤比率较高的多肽核酸寡聚体易与互补的DNA/RNA结合形成（PNA）₂-DNA/RNA三聚体,两条PNA链分别遵守Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对原则。三聚体比二聚体有更高的稳定性。PNA是很有希望的反义基因药物,已有研究表明针对mRNA和rRNA肽基转移中心序列的PNA对细菌蛋白合成有明显的抑制作用。在23SrRNA domainⅡ中,G1138、C1045和A1067是GTPase相连区,与rRNA肽基转移中心以及EF-G延长因子有着密切的联系,同时G1138,C1045以及A1067位点区域为PNA可进入位点。Hanvey等研究表明,在细胞内由于高离子浓度,PNA难以与dsDNA结合,但能与单链RNA形成高稳定性杂交复合物。PNA不能被微生物有效吸收,而且通过脂质双分子层非常缓慢。另外,PNA的分子量超过了大肠杆菌细胞壁上非特异性孔道所能通过的分子量的极限。然而,研究表明KFFKFFKFFK载体肽能有效提高PNA进入E.coli后的反义效果。本研究选择大肠杆菌G1138,C1045以及A1067作为反义结合位点设计PNA,用体外翻译系统筛选有抑制蛋白合成效果的PNA。再针对有抑制蛋白合成效果的PNA设计肽-PNA,观察其抑制大肠杆菌DH5α的生长。第一部分可溶性天然型增强绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）在大肠杆菌和体外翻译系统中的表达目的构建能在大肠杆菌BL₂₁（DE₃）和体外翻译系统中大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白（EGFP）的pET28a-EGFP载体。方法以质粒pEGFP-N1为模板采用聚合酶链反应（PCR）方法特异性扩增EGFP cDNA序列,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切EGFP cDNA序列和pET28a载体,T₄DNA连接酶连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α。对重组质粒酶切鉴定和DNA测序,正确重组的表达型质粒命名为pET28a-EGFP。将正确重组的质粒pET28a-EGFP转化感受态大肠杆菌BL₂₁（DE₃）,用IPTG诱导表达。荧光显微镜观察荧光,用western blot鉴定EGFP。在体外翻译系统中加入重组pET28a-EGFP模板,孵育2小时后,荧光显微镜观察荧光。第一抗体分别为EGFP抗体、T₇-tag抗体和His-tag抗体的western blotting鉴定体外翻译系统中的EGFP。结果经测序证实,重组质粒pET28a-EGFP中的EGFP cDNA序列与GenBank的EGFP cDNA序列完全一致,荧光显微镜下观察到大肠杆菌BL₂₁（DE₃）和体外翻译系统中强烈荧光,Western blotting结果显示分子量约为2.7kd的天然型EGFP在大肠杆菌BL₂₁（DE₃）和体外翻译系统中高效表达。结论成功构建了能在BL₂₁（DE₃）大肠杆菌和体外翻译系统中高效表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白（EGFP）的pET28a-EGFP载体。为体外研究提供了可靠的报告分子。也为进一步建立荧光强度标准奠定了基础。同时,提供了一种设计引物的新思路。第二部分靶向23SrRNA domainⅡ区的多肽核酸（peptide nucleic acids,PNAs）体外抑制细菌蛋白翻译目的尝试研究反义多肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）在体外翻译系统中抑制细菌蛋白的翻译。方法以增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告分子,将重组载体pET28a-EGFP和靶向23SrRNA domainⅡ区的PNAs在体外翻译系统中共同孵育后,用荧光显微镜和荧光分光光度计观察荧光强度减弱,放射自显影证明荧光强度减弱是因为EGFP减少。为了分析PNAs体外抑制蛋白翻译的浓度,我们用蛋白沉淀方法分析PNAs体外抑制[³⁵S]-met渗入蛋白比例。最后,用浊度分析观察PNA在MH肉汤培养基中的抑菌作用。结果在体外翻译系统中,靶向23SrRNA domainⅡ区的PNA（G1138）以剂量和序列依赖方式抑制蛋白合成,抑制效果和四环素相当,抑制浓度(IC₅₀)分别是0.15μmol/L和0.12μmol/L。PNA（G1138）在MH肉汤培养基中的抑菌效果不明显,最小抑菌浓度＞50μmol/L。结论23SrRNA domainⅡ区的G1138位点是设计PNA基础的反义抑菌药物的理想靶位。PNA（G1138）不能被大肠杆菌DH5α有效吸收。第三部分靶向23SrRNA domainⅡ区的肽-PNAs抑制细菌生长的研究目的进一步研究肽-PNA（G1138）抑制细菌生长效果方法用浊度分析观察肽-PNA（G1138）抑制大肠杆菌DH5α的生长。用克隆形成单位（CFUs）进一步分析肽-PNA（G1138）抑菌效果。结果靶向23SrRNA domainⅡ区肽-PNA（G1138）显示出剂量和序列特异性抑制细菌生长,但是肽-PNA（G1138）的最小抑菌浓度（MIC）明显高于四环素,抑制效果明显低于四环素。它们的最小抑菌浓度（MICs）分别是10μmol/L和4μmol/L。结论10μmol/L的Peptide-PNA（G1138）能够抑制大肠杆菌DH5α的生长,但与四环素和其它靶向23SrRNA domainⅤ区的PNAs比较起来抑菌效果不理想。筛选更有效的转运肽,提高peptide-PNA（G1138）的抑菌效果,这是以后研究将要努力解决的问题。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-11
前言  11-19
第一部分可溶性天然型增强绿色荧光蛋白在大肠杆菌和体外翻译系统中的表达  19-45
  一、材料  21-25
  二、方法  25-34
  三、结果  34-43
  四、讨论  43-45
第二部分靶向23SrRNA domain II区的多肽核酸(PNAs)体外抑制细菌蛋白翻译  45-60
  一、材料  46-49
  二、方法  49-51
  三、结果  51-58
  四、讨论  58-60
第三部分靶向23SrRNA domain II区的肽-PNAs抑制细菌生长的研究  60-69
  一、材料  61-62
  二、方法  62-63
  三、结果  63-66
  四、讨论  66-69
小结  69-71
参考文献  71-79
综述  79-94
博士期间发表的论文  94-95
缩写词表  95-97
致谢  97

靶向23SrRNA domain Ⅱ区的多肽核酸（peptide nucleic acids, PNAs）抑制蛋白翻译和细菌生长的研究

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