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乙烯受体基因LeETR1和LeETR2反义转化番茄纯合体的鉴定及其表型的初步研究

作　者: 向庆宁
导　师: 张明方；应铁进
学　校: 浙江大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄乙烯受体 LeETR1、LeETRZ 反义抑制纯合系乙烯敏感性形态建成成熟衰老器官脱落负调控模型
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

乙烯是植物体内结构最为简单的激素，其生物合成途径早已被阐明，从上个世纪90年代人们就开始了对乙烯受体和信号传导的研究。ETR1是五个乙烯受体基因家簇（ETR1，ERS1，ETR2，EIN4，ERS2）中的一员，对他们的功能缺失突变体研究表明他们在乙烯受体系统中可能是起负调控作用。目前已经从模式植物番茄中分离了6个受体基因（LeETR1～6），对它们的基因和蛋白结构特征、表达特性等已经有较多的研究，但是对组成型表达受体基因在乙烯受体系统中的功能研究较少。目前只有一篇文献初步报道了LeETR1（Whitelaw et al,2002）的功能，对这两个受体在乙烯受体系统中的功能定位仍然不清楚。本研究以反义乙烯受体LeETR1，LeETR2基因番茄T₀代种子为实验材料，利用GUS基因表达研究外源基因的遗传规律，并借助于PCR技术对目的和标记基因的鉴定获得转基因T₁代材料。利用GUS基因在T1花粉中的表达鉴定获得转基因纯合植株。研究了转基因后代的生长发育模式、对外源乙烯敏感性，以及靶基因的表达特性，初步探明了它们在乙烯受体系统中的功能。主要结果如下：（1）我们对外源基因在番茄体内的遗传规律研究表明，在大多数情况下，单拷贝插入外源基因将导致转基因后代按孟德尔单显性基因3∶1规律分离，但是部分转化系比例偏低，可能发生了基因丢失或者沉默。（2）通过对转基因T1代的花粉GUS基因表达检测，快速鉴定和筛选得到了番茄纯合植株，加速了纯合体筛选的进程，证明此方法可靠，而且不会造成大量宝贵材料的浪费。（3）两个基因在反义植株里的表达都受到不同程度的抑制。在反义LeETR1植株里，LeETR1表达被抑制后，LeETR2的表达也受到不同程度的抑制。同时，反义LeETR2植株里也有相似的结果。（4）从表型来看，反义LeERT2基因番茄植株节间长从对照的7-8厘米减少到4-5厘米，几乎丧失了顶端优势，第5到9侧枝的长度分别是对照侧枝长度的1.6～1.9、2.4、2.0～2.5、2-2.5、2.4-3.2倍左右。转反义受体LeETR1基因番茄的叶片表现出短暂的偏上性生长。（5）植株衰老和叶片脱落延迟，花瓣脱落也明显的延迟，在转反义LeETR1基因番茄的果实成熟特性被明显改变，表现在乙烯释放高峰延迟，果实颜色出现变异，以及和成熟相关的酶活性的改变，然而，转反义LeETR2基因的果实的成熟特性与对照相比无明显差别。（6）反义LeETR2基因植株外植体，幼苗、黄化幼苗等对外源乙烯敏感性下降。

全文目录

中文摘要  7-8
英文摘要  8-10
前言  10-12
1 文献综述  12-21
  1．1 乙烯与植物营养生长和发育  12-15
    1．1．1 乙烯在合成途径上受生长素的调控  13
    1．1．2 乙烯在信号传导途径上受生长素的调控  13-14
    1．1．3 乙烯和脱落酸在信号传导水平上的相互作用  14-15
  1．2 乙烯受体在番茄上的功能研究  15-21
    1．2．1 番茄乙烯受体基因的表达模式  17
    1．2．2 番茄乙烯受体基因结构  17-19
    1．2．3 番茄乙烯敏感性调节  19-21
2 LeETR1和LeETR2反义转基因植株纯合株系的筛选和目的基因的遗传规律  21-31
  2．1 本课题前期研究工作  21-22
  2．2 材料和方法  22-24
    2．2．1 番茄根GUS组织化学染色法  22
    2．2．2 花粉GUS组织染色  22-23
    2．2．3 T_1和T_2代番茄植株PCR检测和验证  23-24
  2．3 结果与分析  24-28
    2．3．1 GUS基因在番茄根组织中的表达研究外源基因的遗传规律  24-25
    2．3．2 花粉GUS染色快速鉴定转基因T_1代纯合植株  25-28
  2．4 讨论  28-31
3 乙烯受体基因LeETR1和LeETR2功能的初步研究  31-50
  3．1 材料和方法  31-35
    3．1．1 叶片组织RNA的提取  31-32
    3．1．2 植物总RNA变性电泳及转膜  32-33
    3．1．3 探针标记  33
    3．1．4 茎、侧枝生长特性  33
    3．1．5 番茄花瓣的脱落观察  33
    3．1．6 呼吸强度测定  33-34
    3．1．7 果实乙烯释放量测定  34
    3．1．8 果实硬度测定  34
    3．1．9 番茄果实色素测定  34
    3．1．10 纤维素酶（cellulase）活性测定  34
    3．1．11 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性测定  34
    3．1．12 乙烯敏感性试验  34-35
  3．2 结果与分析  35-44
    3．2．1 转基因番茄T_1代叶片LeETR1和LeETR2基因的表达特性  35-37
    3．2．2 LeETR2基因对节间伸长生长的调控  37-38
    3．2．3 LeETR2基因对侧芽伸长生长调控  38-39
    3．2．4 LeETR2反义转基因番茄果实呼吸强度和乙烯释放强度的变化  39
    3．2．5 LeETR2反义转基因番茄的果实色素变化  39-41
    3．2．6 LeETR2反义转基因番茄果实硬度变化  41
    3．2．7 LeETR2反义转基因番茄果实纤维素酶、PG活性变化  41-42
    3．2．8 LeETR2对花瓣脱落和叶片衰老调控  42-43
    3．2．9 LeETR2基因在调节外源乙烯敏感性中的作用  43-44
  3．3 讨论  44-50
    3．3．1 LeETR1，LeETR2两个基因表达的相互关系  44-45
    3．3．2 LeETR2与植株生长矮化和侧枝生长的关系  45-47
    3．3．3 两个基因在延迟衰老和脱落中的作用  47-48
    3．3．4 乙烯信号传导中调控模型的商榷  48-50
4 结论及后续研究展望  50-53
参考文献  53-61

乙烯受体基因LeETR1和LeETR2反义转化番茄纯合体的鉴定及其表型的初步研究

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