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肺炎链球菌中HtrA和PpmA的结构研究

作　者: 张辰晨
导　师: 周丛照
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 温度依赖 丝氨酸蛋白酶 肽基脯氨酰顺反异构酶 晶体结构
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


1.肺炎链球菌中温度依赖的蛋白HtrA的结构研究HtrA (high-temperature requirement A)是一种温度依赖的热休克蛋白,它通过感应外界温度的变化来调节两种功能的转化,分别是:正常温度时行使分子伴侣功能,以及温度升高时的丝氨酸蛋白酶活性。这种功能上的精确转化使得HtrA在维持蛋白质的稳定性以及降解热变形的蛋白以维持细胞的稳定性过程中起关键作用。它被认为是细菌周质间隙中蛋白质质量调控体系中的关键蛋白。研究证实HtrA对于帮助细菌和细胞抵抗高温损伤都有重要作用。HtrA家族蛋白广泛分布在从古细菌到人类的许多的组织中。近期的生物化学和结构学研究证实,不管是细菌抵抗一系列的环境压力还是蛋白质质量调控,都是通过HtrA家族蛋白的结构和功能的精确变化来完成的。然而,其精确的蛋白质质量调控方式还有待研究。为了更好的解析HtrA家族蛋白的作用作用方式,需要进一步对其进行生物化学和结构学研究,帮助我们对其分子功能以及其特殊的分子调控机制有更好的理解。我们已经得到了肺炎链球菌的基因组DNA,经过PCR扩增出一个htrA全长基因和丝氨酸蛋白酶功能域片段,随后分别插入p28质粒进行表达载体的构建。其中全长蛋白经过表达优化与纯化后,可以得到大量的可溶状态。蛋白质初筛后得到晶体,目前我们尝试优化了各种条件,但是没有优化到合适于X射线衍射的蛋白晶体。2.肺炎链球菌中假定的蛋白酶成熟蛋白PpmA的结构研究在过去的20年中,肽基脯氨酰顺反异构酶积累了大量的研究数据,分别在生理,细胞生化,分子动力学以及蛋白质结构研究中取得了相当多的进展。尽管肽基脯氨酰顺反异构酶催化的顺反异构作用本身并不复杂,但是但目前为止对于详细的蛋白催化机理仍没有得到完全的解释。我们研究的PpmA (Potential proteinase maturation protein A)属于被广泛研究的肽基脯氨酰顺反异构酶的小细胞蛋白家族。我们已经得到了肺炎链球菌的基因组DNA,进行PCR扩增出一个ppmA全长基因和一个功能域片段,随后分别插入p28质粒进行表达载体的构建。其中PpmA全长蛋白经过表达优化与纯化后,可以得到大量的可溶状态,但是晶体筛选后没有得到蛋白晶体。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章 肺炎链球菌中温度依赖的蛋白酶A 的结构研究  9-38
  1.1 引言  9-19
    1.1.1 概述  9
    1.1.2 温度依赖的蛋白酶A 的已知结构和可能的催化机制  9-17
    1.1.3 温度依赖的蛋白酶A 的生理功能  17
    1.1.4 肺炎链球菌中温度依赖的蛋白酶A 的研究进展  17-19
  1.2 实验材料与方法  19
  1.3 实验结果与讨论  19-35
    1.3.1 SP_2239-NHis6 全长克隆质粒的构建和重组蛋白的表达纯化  19-20
    1.3.2 SP_2239-NHis6-CHis6 全长重组质粒的构建和重组蛋白的表达纯化  20-22
    1.3.3 SP_2239-NHis6-CHis6 全长重组蛋白的晶体筛选和优化  22-25
    1.3.4 SP_2239 蛋白酶区亚克隆质粒的构建和重组蛋白的表达纯化  25-27
    1.3.5 SP_2239 蛋白酶区亚克隆蛋白的晶体筛选  27-28
    1.3.6 SP_2239-S234A 全长重组质粒的构建和重组蛋白的表达纯化  28-30
    1.3.7 SP_2239-S234A 全长重组蛋白的晶体筛选和优化  30-31
    1.3.8 SP_2239-△N70-S234A 亚克隆质粒的构建和重组蛋白的表达纯化  31-34
    1.3.9 SP_2239-△N73-S234A 重组蛋白的晶体筛选和优化  34
    1.3.10 SP_2239 全长重组蛋白数据收集以及处理  34-35
  1.4 结论和展望  35-38
第二章 肺炎链球菌假定的蛋白酶成熟蛋白A 的结构研究  38-48
  2.1 引言  38-41
    2.1.1 概述  38-39
    2.1.2 肺炎链球菌中假定的蛋白酶成熟蛋白A 的的研究进展  39-41
  2.2 实验材料与方法  41
  2.3 实验结果与讨论  41-46
    2.3.1 SP_0981 全长重组质粒的构建和重组蛋白的表达纯化  41-43
    2.3.2 SP_0981 重组蛋白的晶体筛选  43
    2.3.3 SP_0981△C16 亚克隆质粒的构建和重组蛋白的表达纯化  43-45
    2.3.4 SP_0981△C16 重组蛋白的晶体筛选  45
    2.3.5 与SP_0981△C16 重组蛋白有相互作用的14KD 杂蛋白  45-46
  2.4 结论与展望  46-48
参考文献  48-52
附件  52-59
  1.1 实验材料与方法  52-58
    1.1.1 基因克隆及表达质粒的构建  52-57
    1.1.2 重组蛋白表达与纯化  57-58
    1.1.3 蛋白质晶体筛选与优化  58
    1.1.4 晶体衍射数据的收集与处理  58
  1.2 实验材料与方法  58-59
在读期间发表的学术论文  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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