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抗EGFRvⅢ单克隆抗体制备及其在肝癌治疗中的应用

作　者: 王华茂
导　师: 顾健人
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: EGFRvIII 杂交瘤单克隆抗体活体荧光成像解离常数肝细胞肝癌 5-FU 成瘤性药物敏感性 12H23 联合治疗 DPD TS E2F-1 OPRT 抗体基因克隆嵌合抗体 CHO-DG44 基因重组 C12单抗
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

抗体治疗是生物治疗的一个重要方面,也是肿瘤生物治疗的一个重要方向。其中抗表皮生长因子受体（EGFR）治疗性抗体药物已经在多种肿瘤治疗中应用。但是EGFR在多种正常细胞和组织中均有表达,使得EGFR抗体具有一定的局限性,而表皮生长因子受体3型突变体（EGFRvⅢ）仅在肿瘤中存在,因此相对于EGFR,EGFRvⅢ是一个更为理想的靶点。本研究旨在开发抗EGFRvⅢ的单克隆抗体以及验证其在肿瘤治疗中的有效性,为肿瘤治疗药物开发提供一个具有潜在价值的治疗性抗体。第一部分抗EGFRvⅢ单克隆抗体的制备及其特征分析【目的】寻求可以与表皮生长因子受体3型突变体（EGFRvⅢ）受体特异性结合的单克隆抗体。【方法】以EGFRvⅢ重组蛋白和NIH-3T3 EGFRvⅢ稳定转染细胞系为抗原免疫BLAB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞系融合筛选得到特异性单克隆抗体细胞株。通过western blot、免疫组化和体内荧光成像等方法鉴定抗体的特异性。利用SPR技术测定抗体亲和力常数,ELISA方法测定抗体亚型,通过抗原分段表达并ELISA方法鉴定抗体结合表位。【结果】通过杂交瘤融合技术,经过融合、筛选和克隆化,获得了多株杂交瘤细胞株。其中单克隆抗体12H23能和表达EGFRvⅢ的U87-EGFRvⅢ细胞结合,和过表达EBFR的A431细胞有较弱的结合,但是和野生型的U87细胞没有明显的结合能力。活体荧光成像分析表明12H23可以富集到U87-EGFRvⅢ种植瘤中。对抗体进一步分析显示12H23属于IgG1亚型,识别的序列包含在EGFR 287—302aa（CC16多肽）内,该多肽的C端对抗体的结合更重要。另外该抗体具有较高的亲和力,其与抗原表位结合的解离常数Kd=1.73×10^-10M。【结论】我们利用EGFRvⅢ重组蛋白和NIH-3T3稳转细胞系混合免疫的方法,成功获得了具有与EGFRvⅢ高效结合的单克隆抗体。第二部分EGFRvⅢ在肝癌中的存在与作用【目的】鉴定EGFRvⅢ在肝癌中的存在与作用。【方法】通过western blot及RT-PCR等方法鉴定肝癌细胞系中EGFRvⅢ的表达情况,通过免疫沉淀、westernblot和RT-PCR方法鉴定肝癌组织中EGFRvⅢ的存在。利用稳定转染EGFR或EGFRvⅢ的Huh-7细胞系（分别称为Huh7-EGFR和Huh7-EGFRvⅢ）,通过细胞迁移、MTT等实验测定EGFRvⅢ对肝癌细胞系的生长以及对5氟尿嘧啶（5-FU）耐药性的影响。通过体内的成瘤实验测定EGFRvⅢ对肝癌细胞系成瘤能力进行鉴定。【结果】多种肝癌细胞系和肝癌组织中有检测到EGFRvⅢ的存在。EGFRvⅢ阳性的细胞生长速度较快,并且对5-FU较不敏感。Huh7-EGFRvⅢ细胞表现出较快的体内外生长、较强的迁移及较高的5-FU抵抗能力。【结论】EGFRvⅢ在肝癌细胞和肝癌组织中存在,它能够促进肝癌细胞的成瘤,同时和肝癌的5-FU敏感性有关。第三部分12H23单抗对表达EGFRvⅢ的肝癌细胞系的作用及其与5-FU联合对肝癌作用及初步机理研究【目的】验证抗EGFRvⅢ单克隆抗体12H23单独作用或与5-FU联合对肝癌的治疗作用。【方法】通过体外的MTT细胞毒性实验和体内的Huh7-EGFRvⅢ种植肿瘤模型的治疗作用,来验证12H23抗体对细胞增殖的抑制作用和潜在的治疗价值。通过western blot和荧光定量PCR等方法鉴定治疗前后相关基因的表达情况。【结果】12H23抗体在体外可抑制细胞增殖并促进5-FU的杀伤作用。体内治疗实验的结果显示25 mg/kg的12H23抗体可以显著抑制细胞肿瘤的生长,抑制率到达59.8%。此外相对较低浓度（12.5 mg/kg或5 mg/kg）的12H23抗体和5-FU（25 mg/kg）对Huh7-EGFRvⅢ种植瘤均有联合治疗作用。机理研究表明12H23可以通过降低DPD、TS和E2F-1的表达及提高OPRT表达来增强肝癌对5-FU的敏感性。【结论】12H23单抗具有对EGFRvⅢ表达阳性的肝癌的潜在治疗价值。12H23可望和5-FU联用增加对EGFRvⅢ阳性的肝癌的疗效。第四部分EGFRvⅢ人鼠嵌合单抗的制备及其初步特征分析【目的】重组表达EGFRvⅢ嵌合抗体并对抗体特性进行初步分析。【方法】通过RACE方法获得12H23抗体可变区基因序列,通过基因重组技术构建人鼠嵌合抗体的表达质粒,然后转染CHO细胞,筛选得到稳定表达抗体的细胞株,并通过ELISA免疫组合等方法,验证抗体的亲和力和特异性。【结果】成功获得了稳定高表达嵌合抗体的CHO细胞株,表达纯化的C12抗体经ELISA检测显示C12抗体和12H23识别同样的位点,具有类似的亲和力。免疫组化显示,C12抗体可以和EGFRvⅢ以及表达EGFR的Huh-7细胞结合,而与野生型的Huh-7细胞没有明显结合。【结论】我们成功构建了EGFRvⅢ的特异性嵌合抗体,并实现了在CHO细胞上的稳定高表达。而该嵌合抗体C12很好的保留了鼠源的12H23的亲和力和特异性,为后续进一步的临床前和临床实验提供了一个坚实的基础。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-12
第一部分抗EGFRvⅢ单克隆抗体的制备及其特征分析  12-34
  材料与方法  12-26
  结果  26-32
  讨论  32-33
  小结  33-34
第二部分 EGFRvⅢ在肝癌中的存在与作用  34-50
  材料与方法  34-39
  结果  39-47
  讨论  47-49
  小结  49-50
第三部分 12H23单抗对表达EGFRvⅢ的肝癌细胞系的作用及其与5-FU联合对肝癌作用及初步机理研究  50-64
  材料与方法  50-54
  结果  54-62
  讨论  62-63
  小结  63-64
第四部分 EGFRvⅢ人鼠嵌合单抗的制备及其初步特征分析  64-79
  材料与方法  64-74
  结果  74-77
  讨论  77-78
  小结  78-79
参考文献  79-86
综述  86-106
  参考文献  102-106
论文和专利  106-107
致谢  107-108

抗EGFRvⅢ单克隆抗体制备及其在肝癌治疗中的应用

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