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肠道病毒71型VP1-VP4在重组腺病毒系统中的表达及免疫学评价

作　者: 戈小琴
导　师: 孙茂盛；李鸿钧
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 手足口病肠道病毒71型 P1基因 3CD基因重组腺病毒
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是导致婴幼儿感染的重要病原之一,可引起多种疾病,具有较广的疾病谱。其中由EV71引起的儿童手足口病(Hand, Foot, and Mouth Disease, HFMD)最为常见,而且在婴幼儿容易造成脑干脑炎等神经系统感染导致死亡。EV71近年有多地区流行的趋势。EV71在分类上属于小RNA病毒科肠道病毒属,基因组为正链单股RNA。基因组全长7500bp,编码区仅有一个开放阅读框(ORF),编码约2200个氨基酸的多聚蛋白(Polyprotein),该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白,P1蛋白在3CD蛋白酶的切割作用下生成VP1、VP2、VP3与VP4四种结构蛋白。其中VP1、VP2和VP3裸露于病毒颗粒的表面,VP4位于病毒颗粒衣壳内侧与基因组RNA紧密连接,共同构成EV71的抗原区。研究资料表明,虽然该病毒主要抗原决定区位于VP1,但是VP2、VP3以及VP4上均有抗原抗体结合功能；已有的实验结果显示单独的VP1和VP3免疫原性有限,若能获得VP1～VP4,免疫原性将会得到明显提高。鉴于此,我们首先对从流行区分离的EV71病毒进行了血清学和分子生物学方面的鉴定,采用RT-PCR的方法克隆了P1和3CD基因,借助于载体pcDNA3.0BA勾建双顺反子穿梭质粒pShuttle-CMV-P1-3CD和单基因的穿梭质粒pShuttle-CMV-P1与pShuttle-CMV-3CD.经同源重组获得了重组腺病毒质粒rAd-P1-3CD, rAd-P1、rAd-3CD,分别转染293细胞进行包装,获得相应的重组腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和-Ad-3CD,经RT-PCR检测表明,三个重组腺病毒均已转录目的基因nRNA;免疫荧光和免疫组化检测结果表明仅双顺反子重组腺病毒rAd-P1-3CD中可检测到特异性目的蛋白,而rAd-P1、rAd-3CD中未能检测到特异性的表达产物,结果表明重组腺病毒可有效表达EV71 P1和3CD基因,仅含P1或3CD基因的重组腺病毒表达产物未能被特异性抗体所识别,而含P1及3CD蛋白酶基因的双顺反子重组腺病毒表达产物具有EV71特异抗原性,提示P1蛋白只有在3CD蛋白酶的切割作用下才具有抗原性；重组腺病毒通过滴鼻、灌胃和皮下注射的方式分别免疫BALB/C小鼠,ELISA去检测结果表明：实验组小鼠血清中均检测到抗EV71特异性IgG的抗体,且由rAd-P1-3CD免疫后产生的抗体水平明显高于rAd-P1和rAd-3CD共免疫产生的抗体水平；三种不同的免疫方式结果证明,灌胃免疫方式最佳,滴鼻次之,皮下注射产生的抗体水平最低。目前有限次数的中和试验还未能在实验组血清中检测到EV71特异性保护作用,其原因还有待进一步研究。本实验成功克隆了包含EV71全部结构蛋白区基因P1和具有切割作用的蛋白酶3CD,初步探索了EV71病毒蛋白之间的相互作用,为研究EV71结构蛋白与非结构蛋白之间的关系打下了基础；为找寻最合理的相关重组腺病毒疫苗的免疫方式做了初步的探索实验,为EV71基因工程疫苗的研究做了前期的基础工作。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-14
一、实验材料  14-17
  (一) 菌株及载体  14
  (二) 病毒及细胞  14-15
  (三) 主要试剂  15-16
  (四) 主要仪器  16-17
  (五) 实验动物  17
二、实验方法  17-31
  (一) 引物设计及合成  17-18
    1. EV71特异性检测引物合成  17
    2. 基因的克隆合成  17-18
  (二) 毒株的分离、传代及滴度检测  18-19
    1. EV71原代分离  18
    2. EV71病毒的扩增及滴度检测  18-19
  (三) 毒株的鉴定  19-20
    1. 形态学检测  19
    2. 血清中和实验  19-20
    3. 异核酸片段的鉴定  20
  (四) 目的基因的克隆及穿梭质粒的构建  20-23
    1. 目的基因的克隆  20-21
    2. 双顺反子的构建  21-22
    3. 穿梭质粒构建  22-23
  (五) 重组腺病毒质粒的构建  23-25
    1. 重组穿梭质粒的线性化及去磷酸化  23
    2. 穿梭质粒与复制缺陷型腺病毒载体的重组  23
    3. 阳性重组腺病毒质粒的大量扩增  23-25
  (六) 重组腺病毒的包装  25-26
    1. 重组腺病毒转染293细胞  25
    2. 重组腺病毒收获,传代  25
    3. 重组腺病毒滴度检测  25-26
    4. 重组腺病毒蔗糖垫浓缩  26
  (七) 目的基因表达的检测  26-28
    1. RT-PCR检测  26-27
    2. 免疫荧光检测  27
    3. 免疫细胞组化检测  27-28
  (八) 实验动物免疫  28-31
    1. EV71特异血清获得  28-29
    2. 重组腺病毒免疫BALB/C小鼠  29-31
三、实验结果及分析  31-46
  (一) 分离毒株在Vero细胞上的生长特性  31
  (二) 分离毒株的特异性  31-33
    1. 血清中和试验  32
    2. EV71特异性基因片段鉴定  32-33
    3. EV71形态学观察  33
  (三) EV71病毒滴度检测  33-34
  (四) EV71特异血清效价检测结果  34
  (五) 目的基因的克隆  34-35
  (六) 穿梭质粒的鉴定  35-36
  (七) 重组腺病毒质粒的鉴定  36
  (八) 重组腺病毒的获得  36-37
  (九) 重组腺病毒形态学观察  37-38
  (十) 重组腺病毒中目的基因的表达  38-42
    1. 目的基因mRNA的转录水平  38-40
    2. 免疫荧光检测目的蛋白的表达  40-41
    3. 免疫细胞组化检测目的蛋白的表达  41-42
  (十一) 重组腺病毒免疫原性及抗原性检测  42-46
四、讨论  46-49
  (一) 表达系统的选择  47
  (二) 目的基因的克隆  47-48
  (三) 重组腺病毒的包装  48
  (四) 重组腺病毒滴度与代次关系  48
  (五) 重组腺病毒中外源目的基因的转录和表达  48-49
  (六) 免疫原性的鉴定  49
五、小结  49-50
六、展望  50-52
论文参考文献  52-57
论文综述  57-66
附录  66-86
致谢  86-87
研究生简历  87
研究生在读期间已发表的文章  87-88

肠道病毒71型VP1-VP4在重组腺病毒系统中的表达及免疫学评价

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