学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

APC蛋白不同功能区域真核表达载体的构建及其对人结直肠癌细胞中β-catenin表达的影响

作　者: 吕梁
导　师: 霍继荣
学　校: 中南大学
专　业: 消化内科
关键词: APC基因 重组质粒 转染 β-连环蛋白
分类号: R735.3
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 271次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


近年来的科学研究发现,超过90%的结直肠癌的发生与经典的Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关,该通路异常激活的标志是β-catenin的稳定和在细胞核内的积聚。在结直肠癌细胞中,Wnt/β-catenin信号的激活主要是因APC基因的突变所导致。超过70%的散发结直肠癌均存在APC基因突变。大多数的APC基因体细胞突变都发生在密码子1250至1500间,该区域的APC突变可导致15氨基酸重复序列和20氨基酸重复序列的部分缺失,使其失去正常调控β-catenin表达的功能。多项研究表明,野生型的APC蛋白导入结直肠癌细胞内,可以降低β-catenin的表达水平。然而由于全长的野生型APC片段较大(大于10kb),直接用于基因治疗的操作性较困难。目的:本研究旨在通过构建、验证含有APC蛋白不同功能区域的重组真核表达载体,研究其功能及其对结直肠癌细胞内β-catenin表达水平的影响,筛选到既可有效降低β-catenin表达水平同时片段长度较小的APC基因片段,为将来的基因治疗奠定一定的实验基础。方法:1、根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,使用Primer premier 5.0软件设计7条引物,以含有APC全长cDNA的pBluescript质粒为模板,扩增APC基因特异性的功能区域片段。将扩增出的APC片段克隆到含有优化突变型绿色荧光蛋白的pEGFP-N3载体的N端,构建含有APC功能区域的重组真核表达载体。2、使用ORF查找器对重组质粒的测序结果进行分析,将返回的翻译蛋白序列在线protein BLAST,检测重组质粒表达APC功能区域和GFP能否融合表达。3、使用脂质体转染法将重组质粒转染结直肠癌细胞HCT 116和HT-29,通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来验证APC功能区域在细胞内的表达。4、通过RT-PCR进一步验证重组质粒在HT-29中的表达及转染效率是否与插入片段的大小及细胞特性密切相关。5、利用Western blot技术检测重组载体对结直肠癌细胞中β-catenin表达的影响。以β-actin作内参,使用统计学软件SPSS13.0对western blot电泳条带的灰度值进行one-way ANOVA分析。结果:扩增了5条APC基因特异性的功能区域片段。构建5个pEGFP-N3-APC结构区域的重组真核表达载体:pEGFP-N3-APC1(APC aa 6-767)、pEGFP-N3-APC2(APC aa 1020-1169)、pEGFP-N3-APC3(APC aa 1262-2033)、pEGFP-N3-APC4(APC aa1020-2033)、pEGFP-N3-APC5(APC aa 1020-1698)。ORF查找器对重组质粒的测序结果分析,重组质粒均可表达APC功能区域和GFP的融合蛋白,APC蛋白同源性为99%以上,GFP蛋白同源性为100%。通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达验证APC功能区域在细胞内的表达,结果显示:5个重组真核表达载体转染HCT 116细胞后,细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达,荧光观察显示转染效率分别约为pEGFP-N3-APC1 50%、pEGFP-N3-APC2 50%、pEGFP-N3-APC3 30%、pEGFP-N3-APC4 30%、pEGFP-N3-APC5 50%,空载体pEGFP-N380%,证明重组载体构建成功,在细胞内均可表达相应的APC功能区域。RT-PCR进一步验证重组质粒在HT-29中的表达,RT-PCR结果显示,5个重组质粒在HCT 116和HT-29细胞中的表达基本一致。转染效率与插入片段的大小及细胞特性密切相关。Western blot技术检测重组载体对结直肠癌细胞中β-catenin表达,结果显示:在HCT116细胞中,条带灰度值间的差异无显著性(p>0.05),重组质粒对细胞内β-catenin的表达无明显影响。在HT-29细胞中,前四组条带(分别是未转染细胞、转染pEGFP-N3-APC1、转染pEGFP-N3-APC2和转染pEGFP-N3-APC3的细胞)灰度值间的差异无显著性(p>0.05),而后两组(转染pEGFP-N3-APC4和转染pEGFP-N3-APC5的细胞)的条带灰度值同前相比,差异有显著性(p<0.05)。重组质粒pEGFP-N3-APC4和pEGFP-N3-APC5转染入HT-29细胞后可明显降低细胞内β-catenin的表达。pEGFP-N3-APC4和pEGFP-N3-APC5相比较而言,pEGFP-N3-APC5的片段长度相对较小。结论:本实验研究根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,使用Primer premier 5.0软件设计7条引物,以含有APC全长cDNA的pBluescript质粒为模板,扩增的5条APC基因特异性的功能区域片段中,经构建重组、ORF查找器对重组质粒的测序、转染、功能证实及Western blot技术检测重组载体对结直肠癌细胞中β-catenin表达的影响,证实5个重组载体构建成功,在细胞内均可表达相应的APC功能区域。APC功能区域在细胞内的成功表达,为进一步研究其在细胞内的功能提供了基础。在Western blot技术检测重组载体对结直肠癌细胞中β-catenin表达证实APC5基因片段是既可有效降低β-catenin的表达同时相对长度较短的最优片段。APC5基因片段在细胞内功能的进一步研究可为基因治疗奠定一定的分子理论与实验依据。

全文目录


中文摘要  3-6
ABSTRACT  6-12
英文缩略词表  12-14
前言  14-17
第一章 pEGFP-N3-APC真核表达载体的构建  17-52
  1.1 实验材料  17-19
    1.1.1 质粒、菌株  17
    1.1.2 主要仪器设备  17-18
    1.1.3 主要试剂  18
    1.1.4 培养基和溶液  18-19
  1.2 实验方法  19-25
    1.2.1 大肠杆菌的培养  19
    1.2.2 APC质粒的转化  19
    1.2.3 APC质粒的提取  19-20
    1.2.4 质粒浓度的测定和鉴定  20-21
    1.2.5 引物的设计与合成  21
    1.2.6 PCR扩增  21-22
    1.2.7 PCR产物纯化及鉴定  22
    1.2.8 PCR产物和pEGFP-N3载体的酶切  22-23
    1.2.9 连接反应  23
    1.2.10 连接产物转化感受态细菌E.coli-TOP10  23-24
    1.2.11 阳性克隆的鉴定  24
    1.2.12 重组质粒pEGFP-N3-APC的提取  24-25
    1.2.13 重组质粒pEGFP-N3-APC的酶切鉴定  25
    1.2.14 重组质粒的测序鉴定  25
  1.3 实验结果  25-47
    1.3.1 pBluescript-APC质粒的鉴定  25-26
    1.3.2 APC片段的扩增  26-27
    1.3.3 pEGFP-N3-APC重组真核表达载体构建示意图  27-28
    1.3.4 pEGFP-N3真核表达载体  28
    1.3.5 扩增出的APC片段及pEGFP-N3载体的双酶切  28-29
    1.3.6 重组pEGFP-N3-APC质粒阳性克隆筛选PCR结果  29
    1.3.7 重组pEGFP-N3-APC质粒以Xho I和BamH I双酶切鉴定  29-30
    1.3.8 重组pEGFP-N3-APC质粒测序及BLAST结果  30-47
  1.4 讨论  47-50
    1.4.1 APC片段的选择  47-48
    1.4.2 pEGFP-N3载体  48-49
    1.4.3 重组载体pEGFP-N3-APC的PCR和酶切鉴定  49
    1.4.4 重组载体pEGFP-N3-APC的测序鉴定及生物信息学分析  49-50
    1.4.5 APC与Axin  50
  1.5 小结  50-52
第二章 人结直肠癌细胞转染条件的优化及重组质粒pEGFP-N3-APC对结直肠癌细胞中β-catenin表达的影响  52-83
  2.1 实验材料  52-55
    2.1.1 质粒和细胞  52
    2.1.2 主要仪器设备  52-53
    2.1.3 主要试剂  53
    2.1.4 培养基和溶液  53-55
  2.2 实验方法  55-60
    2.2.1 质粒提取及浓度测定  55-56
    2.2.2 细胞培养和G418筛选  56
    2.2.3 细胞转染  56-57
    2.2.4 稳定转染细胞株的筛选  57
    2.2.5 RT-PCR测定APC mRNA的表达  57-58
    2.2.6 SDS-PAGE电泳鉴定细胞中蛋白的表达  58-59
    2.2.7 Western blot检测不同载体对HT-29细胞中β-catenin表达的影响  59-60
  2.3 实验结果  60-77
    2.3.1 质粒的浓度测定  60
    2.3.2 G418最低维持浓度的选择  60-61
    2.3.3 细胞转染条件的优化  61-66
    2.3.4 转染后细胞的显微镜下观察  66-74
    2.3.5 SDS-PAGE检测细胞中蛋白的表达  74-75
    2.3.6 RT-PCR检测HT-29细胞中APC mRNA的表达  75
    2.3.7 Western blot检测重组质粒对HCT 116中β-catenin表达的影响  75-76
    2.3.8 Western blot检测重组质粒对HT-29中β-catenin表达的影响  76-77
  2.4 讨论  77-81
    2.4.1 人结直肠癌细胞株的选择  78
    2.4.2 G418筛选  78-79
    2.4.3 转染效率  79-80
    2.4.4 RT-PCR检测细胞中APC mRNA的表达  80
    2.4.5 Western blot检测重组载体pEGFP-N3-APC对人结直肠癌细胞株HCT 116和HT-29中β-catenin表达的影响  80-81
  2.5 小结  81-83
参考文献  83-87
综述  87-105
成果  105-106
致谢  106

相似论文

  1. 聚乙烯亚胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究,R450
  2. 山羊骨髓间充质干细胞生物学特性、冷冻保存及基因转染研究,S827
  3. 新型非病毒基因转染体系的构建及其在骨髓间充质干细胞基因重组中的应用,R346
  4. YB-1 RNAi对肺腺癌细胞A549中MACC1基因表达影响的研究,R734.2
  5. 转染TFPI-2重组质粒对肺癌细胞NCI-H460的影响,R734.2
  6. 建立基于人PPARs为靶标的药物筛选细胞平台,R965.1
  7. 人TLT-2基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制,R392
  8. 猪肌肉组织骨骼肌特异性基因α-actin启动子的克隆及功能验证,S828
  9. Sox9基因修饰人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究,R329
  10. 慢病毒介导HO-1基因转染对骨髓间充质干细胞体外缺血性损伤保护作用的实验研究,R363
  11. 血管内皮生长因子基因转染促进放疗后咬肌血管再生的实验研究,R730.5
  12. pcDNA3.1（+）/ICP27重组HSV-2DNA疫苗的构建及在真核细胞中的表达,R392
  13. 基于实时荧光定量PCR的植物转基因检测技术的改进与应用,S641.2;S666
  14. 真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究,R346
  15. 脉冲电场介导AT2R基因在血管局部表达及其对血管新生内膜影响,R541.4
  16. 曲古抑菌素A（TSA）在IFN-γ调控TRIM22表达中的作用及其机制研究,R346
  17. 2个家族性腺瘤性息肉病家系APC基因E_（15）突变检测,R735.3
  18. 侧链可还原降解的聚乙烯亚胺衍生物的合成和体外基因释放,R346
  19. 牛朊蛋白基因PrP102-242和PrP1-264在COS-7细胞中的表达,S852.659.7
  20. 腈水合酶在大肠杆菌中的表达与纯化,TQ925
  21. 大白猪睾丸组织miRNA同源扩增及不同发育时期表达研究,S828

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com