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hBMP-2基因转染骨髓基质干细胞治疗兔股骨头缺血性坏死

作　者: 毛瑞军
导　师: 玄延花
学　校: 延边大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: hBMP-2 股骨头缺血性坏死骨髓基充质干细胞转染
分类号: R681.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：检测hBMP-2腺病毒(rAAV2-hBMP-2)转染的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的转染效率及转染后的基因表达,探讨转染后BMSCs (?)的生物学特性。研究hBMP-2基因转染的BMSCs在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值。方法：双侧股骨外侧髁和胫骨近端穿刺获取成年新西兰白兔(6月龄,体重2.0-2.5Kg)骨髓,应用密度梯度离心的方法分离兔BMSCs并扩增,加入10ml的1640(含10%的胎牛血清)进行培养。观察细胞形态和生长情况,碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨能力。研究兔BMSCs的成骨潜能。完成腺相关病毒介导hBMP-2 (rAAV2-hBMP-2)制备,以rAAV2-hBMP-2转染兔BMSCs,在细胞80%汇合后行病毒转染过夜,感染倍率为105v. g./cell。收获转染后24h-6d的转染上清,应用Western blot方法检测转染BMSCs中外源hBMP-2基因的转录与表达。36只新西兰白兔建立液氮即刻冷冻股骨头缺血性坏死模型,根据不同移植物随机分为3组,每组12只,A组为空白骨坏死对照组,B组为单纯BMSCs植入组,C组hBMP-2转染BMSCs植入组。造模证实成功后,C型臂监视下,将生理盐水、BMSCs、hBMP-2转染的BMSCs分别植入A、B、C三组骨坏死区域,每组兔分别在术后2、4、8周行影像学检测后处死4只,取下股骨头标本检测。结果：在原代培养中,第4d首次换液,可见少量成纤维细胞样细胞贴壁于培养瓶底,并有少数克隆形成,即来源于成纤维细胞克隆形成单位。第7-10d,克隆逐渐增多、增大,形成直径5mm-8mm的较大克隆和<5mm的小克隆。大部分碱性磷酸酶染色的BMSCs呈阳性反应。hBMP-2基因转染的兔BMSCs可有效表达hBMP-2,其分泌于培养上清中的蛋白产物可促进兔的成骨细胞增值并增加成骨细胞的活性。组织形态学检测发现C组在植入后4周有明显成骨表现,植入后8W时坏死区被完全修复;B组经检测只有较少新骨形成,8周时坏死区多为纤维样组织,C组新骨体积明显大于B组。造模后8周A组股骨头发生塌陷；植入后8周B组股骨头内存在囊状密度减低区；至12周C组股骨头形态规则,未发生塌陷。结论：hBMP-2基因转染的兔BMSCs可有效表达具有生物活性的hBMP-2蛋白,培养上清液中可检测到高水平表达具有成骨能力的hBMP-2蛋白,为以hBMP-2基因和BMSCs为基础的基因治疗在ONFH修复与再造中应用提供了实验基础。hBMP-2基因转染的兔BMSCs治疗兔ONFH较单纯BMSCs有更好的疗效。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章前言  10-12
第二章材料与方法  12-22
  2.1 实验材料与仪器  12-13
    2.1.1 实验动物  12
    2.1.2 实验仪器  12-13
  2.2 主要实验试剂  13
  2.3 实验方法  13-21
    2.3.1 实验动物模型建立与分组  13-14
    2.3.2 兔BMSCs的培养及腺相关病毒的转染  14-15
    2.3.3 携带Hbmp-2腺病毒(rAAV2-hBMP-2)构建  15-18
    2.3.4 腺相关病毒的滴度的测定  18-19
    2.3.5 组织学观察  19-21
  2.4 统计学分析  21-22
第三章结果  22-25
  3.1 动物模型的建立  22
  3.2 股骨头标本大体观察  22
  3.3 HE染色  22-23
  3.4 倒置相差显微镜观察  23
  3.5 荧光显微镜观察转染后细胞形态  23-24
  3.6 Western blot检测Hbmp-2蛋白表达  24
  3.7 细胞内碱性磷酸酶含量测定  24-25
第四章讨论  25-29
  4.1 骨形态发生蛋白(BMPs)的功能  25-26
  4.2 基因导入方法  26
  4.3 载体的选择  26-27
  4.4 基因转染种子细胞的选择  27-28
  4.5 股骨头缺血性坏死的干细胞治疗  28-29
第五章结论  29-30
附图  30-35
致谢  35-36
参考文献  36-40
综述  40-56
  参考文献  51-56

hBMP-2基因转染骨髓基质干细胞治疗兔股骨头缺血性坏死

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