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动态压力作用下体外海藻酸盐微囊化培养兔关节软骨细胞差异蛋白质组学研究

作　者: 任利玲
导　师: 丁寅；冯雪；陈富林
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 软骨细胞海藻酸盐刚度机械压缩差异蛋白质组学双向凝胶电泳基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱
分类号: R684
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

应力作用下软骨细胞代谢和功能的改变是导致软骨组织不断生长改建的主要原因。在正常人体关节软骨所受到的各种力中,压力是最主要的,研究表明,软骨受到动态和静态压缩载荷影响了软骨移植物的生物合成。但到目前为止,有关动态压力作用下调控软骨细胞生物学行为变化的分子机制尚不清楚,通过差异蛋白质组学研究可以识别参与细胞生命活动过程中的重要蛋白质,为深入探索其机制提供信息。本研究力图构建类似于体内软骨组织的体外软骨细胞立体培养动态压力加载模型,并借助于蛋白质组学技术,寻找和发现动态压力作用下调控软骨细胞代谢和功能改变的特定的蛋白质分子,为动态压力作用下软骨改建机理的更深入研究提供依据。研究方法:1)取4W龄乳兔膝关节软骨组织,体外分离、培养软骨细胞、对培养的软骨细胞进行蕃红“O”、甲苯胺蓝及II型胶原免疫组化染色等表型鉴定;2)将鉴定具有正常表型的P1代软骨细胞和海藻酸盐复合,形成凝胶小球培养,观察藻酸钙凝胶内软骨细胞生长情况。通过MTT检测确定细胞活性,使用二甲基亚甲兰法测定样品硫酸化糖胺多糖(GAG)的含量,同时对在藻酸钙凝胶内的软骨细胞进行组织学及组织化学染色以鉴定其表型;3)选取浓度分别为1%、2%、3%海藻酸盐,并通过INSTRON3365测定三种浓度海藻酸盐形成凝胶的机械刚度,将P1代软骨细胞分别与这三种浓度的海藻酸钙复合,培养28天,通过MTT法,二甲基亚甲兰法及RT-PCR测定并比较三种条件下软骨细胞增殖状况,GAG含量变化及II型胶原,聚集蛋白聚糖,I型胶原的基因表达状况从而筛选出最有利于软骨细胞生长的3D海藻酸盐凝胶培养环境;4)仿照Shram系统构建了体外立体培养的软骨细胞动态压力加载模型;并参照Shram等压力加载条件给予0.2MPa,0.66Hz静水压持续作用4h,提取培养相同时间的加压组和未加压组藻酸钙凝胶中的软骨细胞总蛋白,进行双向电泳分离,电泳后的凝胶银染,用分析软件对图谱进行分析,从而建立动态压力作用下藻酸盐立体培养条件下兔关节软骨细胞差异表达蛋白质图谱;5)使用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对得到的肽段进行分析,并结合蛋白质序列数据库,鉴定出差异表达的蛋白点。结果:采用消化法进行幼兔膝关节软骨细胞原代培养,经甲苯胺兰,II型胶原染色鉴定阳性,所培养细胞生长状态良好其软骨细胞表形能够保持3代稳定,且反映其生长增殖能力的生长曲线正常,在体外培养时可经历与在体状况相似的成熟过程,并具有与在体的关节软骨相似的生物学活性。2)在海藻酸钙小球内培养的软骨细胞能够保持球形状态,且随时间的延长,细胞逐渐增殖,GAG含量增多。经蕃红“O”、甲苯胺蓝及II型胶原免疫组化染色均为阳性。鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞。3)浓度对海藻酸钙凝胶的机械刚度具有显著的影响。1%的海藻酸钙凝胶的压缩模量为19.44±2.72显著低于2%(167.09±12.43)和3%(226.24±19.82)。在培养的21天,软骨细胞在较软凝胶内增殖较快,但在21天后,在最软的凝胶内细胞增殖显著减少;基质积累随海藻酸盐刚度改变而不同。在培养第四周,软骨细胞在中间刚度组表现出最高的GAG合成,而软骨特征性基因CoLII、Agg的表达在具有中等刚度的凝胶内最稳定;4)通过双向电泳技术我们建立了动态压力作用下立体培养的软骨细胞差异表达蛋白质图谱。未加压组检测到1632±54个蛋白点,加压组检测到1698±13个蛋白点。通过软件分析,找到了10个差异蛋白点,其中2个在加压培养后表达消失;2个在加压培养后出现表达;6个表达增强。5)将这10个蛋白点通过质谱(MALDI-TOF-MS)分析,获得相应的肽质量指纹图谱,进一步通过蛋白质序列数据库鉴定了8个蛋白点,其中有意义的蛋白点6个。它们分别是:prolyl 4-hydroxylase alpha I,pyruvate kinase,L-lactate dehydrogenase A,Prolyl 4-hydroxylase subunit beta,destrin isoform,alpha enolase。结论:1)采用酶消化法获得幼兔关节软骨细胞的方法简便可行。体外培养的原代或P1,P2代软骨细胞具有良好的软骨细胞表型特征,适用于实验研究。2)软骨细胞在藻酸钙凝胶小球中生长维持了球状形态,细胞少量增殖并合成GAG,II型胶原,说明海藻酸钙凝胶适合于软骨细胞的生长。3)具有中等刚度的海藻酸钙凝胶更有利于软骨细胞的生长和软骨表型的维持。4)利用差异蛋白质组学方法研究动态压力作用对立体培养的软骨细胞的影响是可行的;5)通过差异蛋白质组学研究我们发现了动态压力作用下调控软骨细胞生物学行为的6个有意义的关键蛋白质,并推测了其在软骨改建中的作用。为今后研究这些差异蛋白在软骨细胞受压力刺激后代谢和功能变化的生物学作用奠定了基础。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
前言  15-17
文献回顾  17-38
  一、海藻酸盐的理化特性及其在软骨细胞三维培养中的应用  17-21
  二、水凝胶机械性能对培养细胞的影响  21-26
  三、力学刺激对关节软骨的影响  26-31
  四、差异蛋白质组学技术及其在软骨组织研究中的应用  31-38
正文  38-89
  第一部分兔关节软骨细胞体外立体培养模型的建立及凝胶刚度筛选  38-63
    实验一兔关节软骨细胞的体外分离、培养和鉴定  38-45
      1 材料和方法  39-41
      2 结果  41-43
      3 讨论  43-45
    实验二海藻酸盐微囊化培养兔关节软骨细胞  45-53
      1 材料和方法  45-47
      2 结果  47-51
      3 讨论  51-53
    实验三海藻酸盐凝胶的机械刚度对培养的软骨细胞生物学性状的影响  53-63
      1 材料和方法  54-57
      2 结果  57-60
      3 讨论  60-63
  第二部分动态压力作用下海藻酸盐微囊化培养的兔关节软骨细胞差异表达蛋白质组学研究  63-89
    实验一动态压力作用下立体培养兔关节软骨细胞双向电泳图谱的建立  64-80
      1 材料  65-70
      2 方法  70-75
      3 结果  75-76
      4 讨论  76-80
    实验二差异表达蛋白质点的质谱分析及蛋白鉴定  80-89
      1 材料  80-81
      2 方法  81-82
      3 结果  82-84
      4 讨论  84-89
小结  89-91
参考文献  91-118
个人简历和研究成果  118-119
致谢  119

动态压力作用下体外海藻酸盐微囊化培养兔关节软骨细胞差异蛋白质组学研究

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