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骨髓基质干细胞的成骨示踪研究

作　者: 陈瀛
导　师: 李子荣
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓基质干细胞 细胞示踪 磁共振成像 骨修复 股骨头坏死 细胞诱导
分类号: R681.8
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 321次
引　用: 1次
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内容摘要


研究背景及目的:股骨头坏死(osteonecrosis of femur head,ONFH)是临床上较为常见的难治性疾病之一,多数进展至股骨头塌陷从而继发骨关节炎,多数需行人工关节置换。目前ONFH的早期治疗的重点在于保存股骨头,防止塌陷。股骨头的保存治疗方法很多,但都有各自的优缺点。近年来,骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)移植作为一种新的治疗方法,也用于治疗ONFH。MSCs移植后在体内的转归与作用机制是目前研究的热点。为监测活体内移植细胞的分布、增殖、迁移等,传统方法都需要在离体状态下进行组织学检查,难以准确地观察植入细胞的生长分化情况,无法对干细胞移植的疗效做出客观评价,从而极大的阻碍了干细胞移植在临床应用上的发展。随着分子生物学的发展和分子影像学概念的产生,人类开始能够在细胞分子水平评价活体组织细胞的生物学过程。如利用MRI来监测移植细胞,其最大的优点是能够无创地进行多次重复检测。为能在MRI上区分移植细胞和靶组织细胞,需要对移植细胞进行移植前标记。目前广泛使用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)标记移植细胞。SPIO是一种纳米级粒子,由于其特殊的化学结构,SPIO即使在较弱的磁场中也可以产生较大的磁性,而外磁场撤消后磁性也迅速消失,即具有所谓的超顺磁性,可以使MRI的靶区信号均明显降低,产生负性对比剂的效应,从而经SPIO标记的移植细胞团也就可因含SPIO颗粒而显示为低信号,这样就间接反映了移植细胞的分布和聚集情况。目前应用SPIO进行细胞的体内示踪主要应用于神经系统和心血管系统研究,在骨骼系统中的应用鲜有报道。本实验采用SPIO进行标记细胞的体外实验及模拟股骨头坏死区移植细胞的体内示踪,旨在明确SPIO体外标记狗骨髓间充质干细胞(MSCs)的适当条件,以及经MRI体外成像的特征和可成像的最低标记细胞量等;利用MRI进行移植细胞的示踪,结合组织学观察移植细胞在股骨头内的存活及转归;探讨骨髓基质干细胞的成骨及促进股骨头坏死修复的能力。从而为细胞移植的转归与作用机制研究打下工作基础,为临床应用骨髓基质细胞治疗骨坏死找到一定的理论依据。实验方法:试验分两部分。①超顺磁性纳米氧化铁颗粒(SPIO)体外标记MSCs:抽取狗的双侧髂骨骨髓,行梯度离心及贴壁细胞分离法分离骨髓基质干细胞(MSCs),进行体外培养扩增。按不同SPIO浓度设定实验组,观察不同实验组之间标记率的差异性、对细胞增殖活性的影响、MRI成像的特征和条件等,找到合适的标记条件。观察标记后细胞的远期增殖情况以及SPIO在细胞内的存留稳定性。②细胞的股骨头坏死区内移植及示踪:制备股骨头坏死模型。同时抽取狗双侧髂骨骨髓,行梯度离心及贴壁细胞分离法分离MSCs,进行体外培养扩增。2周后,骨坏死区病灶刮除,将体外标记了SPIO的MSCs与脱抗原小牛松质骨复合,植入骨坏死区,另一侧单纯植入脱抗原小牛松质骨作为对照,术后定期行活体MRI检测,观察不同时间段SPIO的体内成像特点,并取材行组织学对照。利用显微镜、组织化学法及透射电镜等观察SPIO的体外标记情况。行普鲁士蓝染色观察含铁颗粒的细胞在体内的分布、转归等情况。行HE染色及图像分析,观察MSCs在体内的成骨效果。实验结果:①SPIO可以很好的标记MSCs,并长期存留,适当浓度下对细胞活性无影响,一定数量时体外可被MRI所检测。②SPIO标记细胞体内移植侧MRI检测可见明显低密度灶,3个月仍然可被检测到。③股骨头缺损内发现大量SPIO阳性细胞,新骨形成越活跃的地方,SPIO阳性细胞数目越多,很多骨陷窝及骨小梁表面细胞SPIO呈阳性。④MSCs移植侧成骨程度强于对照侧。实验侧的成骨量、骨基质矿化的程度、骨成熟度高于对照侧,含有更加丰富的梭形间充质细胞和成骨细胞。结论:SPIO是良好的细胞示踪剂,MRI体内活体示踪成为可能。移植的骨髓细胞能在股骨头内成活,并能停留在骨缺损部位生长增殖。MSCs能分化成成骨细胞和软骨细胞参与成骨,能促进骨坏死和骨缺损的修复。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
目录  8-9
前言  9-11
第一部分 骨髓基质干细胞的体外SPIO标记研究  11-22
  1 材料和方法  11-15
  2 结果  15-17
  3 讨论  17-21
  4 结论  21-22
第二部分 骨髓基质干细胞体内SPIO标记及成骨性研究  22-33
  1 材料和方法  22-25
  2 结果  25-26
  3 讨论  26-32
  4 结论  32-33
结束语  33-34
参考文献  34-38
附图  38-51
文献综述  51-63
缩略语中英文对照表  63-64
简历  64-65
致谢  65-66

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 骨科学（运动系疾病、矫形外科学） > 骨骼疾病 > 下肢骨
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