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造血细胞分化相关基因的鉴别以及ASB-8和mir-223的功能研究

作　者: 袁金云
导　师: 张俊武
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 红系分化 过表达 巨核系 医科大学 转化子 转录因子 造血细胞 分化相关基因 细胞因子受体 红系祖细胞
分类号: Q343
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


人类造血涉及多能干细胞的自我更新、向多个造血细胞链系的分化决定及进一步分化发育成熟。这个过程涉及关键的转录因子和造血生长因子的协同调控。为了研究造血干细胞链系分化的分子机制,我们首先用免疫磁珠（MACS）从正常成人骨髓中分离CD34+细胞,用特异的表面标志进一步分离获得造血干细胞（HSC;CD34+/CD38-/CD33-）和多能髓系祖细胞（MMP;CD34+/CD38-/CD33+）。同时用特异的细胞因子分别诱导CD34+细胞向红系、巨核系和粒系分化,收集红系祖细胞衍生的集落（EC）、巨核系祖细胞衍生的集落（MC）和粒系祖细胞衍生的集落（GC）。从这些细胞制备RNA并进行逆转录差异显示PCR（DDRT-PCR）分析,共获得差异表达条带（ESTs）近500条。挑选差异表达显著的条带进行PCR再扩增、克隆到T载体、DNA测序并在NCBI进行BLAST比对,发现这些ESTs所代表的基因为转录因子、信号转导分子、细胞代谢酶类、细胞周期调控因子、细胞凋亡相关分子、肿瘤相关分子、核糖体蛋白和未知功能的基因。我们发现特异的基因表达上调和特异的基因表达下调都在HSC链系特异分化中发挥重要作用。这些结果为揭示造血细胞分化的分子机制提供了线索。粒系形成包括HSC向粒系祖细胞的分化决定和进一步分化发育成具有功能活性的成熟粒细胞。这个过程不仅涉及粒系特异转录因子的调控,还涉及细胞因子及其受体、其它转录因子的调控。我们研究了DDRT-PCR分析中一个在GC中特异高表达的基因ASB-8在粒系分化中的作用。用real-time PCR分析验证了ASB-8在GC中高表达,在HSC、MMC、EC和MC中表达很低。在全反式视黄酸（ATRA）诱导NB4和HL-60向粒系分化的过程中,ASB-8 mRNA表达呈现上调趋势。pEGFP-N1-ASB-8融合蛋白定位于NIH-3T3的细胞质,并集中在核周围。我们构建了ASB-8的过表达质粒pcDNA3.1-ASB-8和RNAi质粒pAVU6+27-ASB-8i,分别转染NB4获得ASB-8的过表达稳定转化子pcDNA3.1-ASB-8/NB4和RNAi稳定转化子pAVU6+27-ASB-8i/NB4。与NB4相比,在ATRA诱导之前,在pcDNA3.1-ASB-8/NB4中CD11b mRNA的表达升高,而MPO mRNA的表达无明显变化。在ATRA诱导向粒系分化中,CD11b mRNA在pcDNA3.1-ASB-8/NB4的表达均要高出在相应诱导时间的NB4细胞中的表达,而MPO mRNA的表达无明显差别,但在96h降低为1/3。在ATRA诱导之前,在pAVU6+27-ASB-8i/NB4中CD11bmRNA和MPO mRNA的表达分别只有NB4中的1/10和1/2。在ATRA诱导向粒系分化过程中,在pAVU6+27-ASB-8i/NB4中CD11b mRNA一直处于极低的表达水平,而MPO mRNA的表达基本保持不变。在ATRA诱导向粒系分化48h后,NBT还原试验发现pcDNA3.1-ASB-8/NB4和pAVU6+27-ASB-8i/NB4中的A570nm/106（细胞）要比NB4分别增加13%和减少20%;Gimesa染色发现pcDNA3.1-ASB-8/NB4中的细胞核分叶比NB4中更多,而pAVU6+27-ASB-8i/NB4中的细胞核分叶则更少。这些结果说明过表达ASB-8促进ATRA诱导的NB4向粒系的分化,而ASB-8的表达阻遏则抑制ATRA诱导NB4向粒系的分化。近来的研究表明miRNAs可能参与造血细胞分化的调控。我们课题组先前发现mir-223在红系分化中可能具有一定的调节作用,本文进一步研究mir-223调节红系分化的功能和机制。通过分别转染寡核苷酸小RNA223前体（Pre-mir-223）和小RNA223抑制剂（Anti-mir-223）,分别观察到联苯胺染色阳性细胞百分比以及γ-珠蛋白mRNA表达的降低和升高,说明在K562中mir-223的过表达和表达阻遏分别抑制和促进hemin诱导的红系分化。我们构建了mir-223过表达质粒pcDNA3.1-pri-mir-223（小RNA223初级转录本）和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223,分别转染K562细胞,获得mir-223过表达稳定转化子pcDNA3.1-pri-mir-223/K562和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562。在hemin诱导向红系分化中,在pcDNA3.1-pri-mir-223/K562和pSilencer 2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562中的联苯胺染色阳性细胞百分比和γ-珠蛋白mRNA表达均要低于K562,进一步说明在K562中过表达mir-223会抑制hemin诱导的红系分化。为了鉴别mir-223的靶基因,把LMO2和HLF的3’-UTR插入到pRL-TK和pEGFP-C1,构建了LMO2和HLF-双萤光和荧光报告基因质粒,与Pre-mir-223共转染K562和NIH-3T-3,发现LMO2和HLF-报告基因的表达受到抑制,说明LMO2和HLF可能是mir-223的靶基因。把LMO2-报告基因质粒分别转染到过表达稳定转化子pcDNA3.1-pri-mir-223/K562、pSilencer2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562和K562中,发现LMO2-报告基因在过表达稳定转化子中的表达受到抑制。Real-time PCR还发现LMO2 mRNA在mir-223过表达稳定转化子中的表达要低于K562,这些说明LMO2很可能就是mir-223的靶基因。这些结果提示在hemin诱导K562向红系分化过程中,mir-223表达的降低部分解除了对LMO2表达的抑制,进而促进了红系分化。在PMA诱导向巨核系分化过程中,Giemsa染色发现pcDNA3.1-pri-mir-223/K562的大核和多核细胞比K562多,PI染色后FACS分析发现在pcDNA3.1-pri-mir-223/K562的4倍体细胞数目多于K562。这些结果说明过表达mir-223可能会促进PMA诱导K562向巨核系的分化。

全文目录


英文名词及缩写  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-17
材料与方法  17-42
  1.实验材料  17-25
    1.1 工具酶及分子量Marker  17
    1.2 主要生化试剂  17-18
    1.3 细胞因子与荧光抗体  18
    1.4 试剂盒  18
    1.5 同何素标记化合物  18
    1.6 菌株  18
    1.7 质粒  18-19
    1.8 细胞系  19-20
    1.9 骨髓组织标本  20
    1.10 引物  20-24
    1.11 主要生物软件  24
    1.12 主要仪器及设备  24-25
  2.实验方法  25-42
    2.1 HSC和MMP的分离及CD34+细胞向EC、MC和GC的诱导分化  25-28
    2.2 DDRT-PCR分析  28-31
    2.3 Real time PCR检测mRNA的表达  31-33
    2.4 细胞系培养及诱导  33
    2.5 脂质体介导的真核细胞转染和稳定细胞株的筛选  33-34
    2.6 真核表达质粒的构建  34-36
    2.7 质粒的提取  36-37
    2.8 NB4细胞诱导向粒系分化的检测  37
    2.9 ASB-8在大肠杆菌中的表达  37-38
    2.10 K562诱导向红系分化的检测  38
    2.11 K562诱导向巨核系分化的检测  38-39
    2.12 脂质体介导的miRNA寡核苷酸的真核细胞转染  39
    2.13 miRNA的Real time PCR  39-40
    2.14 miRNA相关质粒的构建  40
    2.15 双萤光报告实验  40-42
实验结果  42-84
  1.HSC和MMP的分离及CD34+细胞向EC、MC和GC的定向诱导分化  42-45
    1.1 HSC和MMP的免疫磁珠分离  42-43
    1.2 CD34+细胞向红系、巨核系和粒系的半固体诱导培养  43-45
  2.HSC、MMP、EC、MC和GC中mRNA表达的DDRT-PCR分析  45-51
    2.1 GAPDH cDNA的PCR扩增  45-46
    2.2 DDRT-PCR分析  46-48
    2.3 差异片段的PCR再扩增  48
    2.4 差异片段的克隆、测序及Blast分析  48-50
    2.5 在一个或多个链系特异表达的mRNA  50-51
  3.ASB-8在ATRA诱导NB4细胞向粒系分化中的功能  51-64
    3.1 ASB-8 mRNA在GC中高表达  51
    3.2 ASB-8 mRNA在ATRA诱导NB4和HL-60向粒系分化中表达上调  51-52
    3.3 ASB-8生物信息学分析  52-53
    3.4 全长ASB-8 cDNA的PCR扩增  53-54
    3.5 ASB-8蛋白主要定位于细胞质  54
    3.6 过表达质粒pcDNA3.1-ASB.8的构建  54-55
    3.7 RNAi质粒pAVU6+27-ASB-8i的构建  55-57
    3.8 稳定转化了pcDNA3.1-ASB-8/NB4和pAVU6+27-ASB-8i/NB4的获得  57-58
    3.9 稳定转化子pcDNA3.1-ASB-8/NB4和pAVU6+27-ASB-8i/NB4的粒系分化分析  58-62
    3.10 稳定转化子pcDNA3.1-ASB-8/HL-60和pAVU6+27-ASB-8i/HL-60的获得  62-63
    3.11 GST-ASB-8和His-ASB-8融合蛋白的诱导表达  63-64
  4.Mir-223在hemin诱导K562向红系分化中的功能作用  64-75
    4.1 在K562中过表达或抑制成熟mir-223后对红系分化的影响  64-67
    4.2 pcDNA3.1-pri-mir-223和pSilencer2.1-U6-Neo-pre-mir-223过表达质粒的构建  67
    4.3 稳定转化子pcDNA3.1-pri-mir-223/K562和pSilencer2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562的获得  67-69
    4.4 稳定转化子pcDNA3.1-pri-mir-223/K562和pSilencer2.1-U6-Neo-pre-mir-223/K562的红系分化分析  69-75
  5.Mir-223调节K562红系分化的分子机制  75-82
    5.1 Mir-223靶基因的检测  75-78
    5.2 Mir-223可能与LMO2 mRNA相互作用  78-80
    5.3 Mir-223对一些红系转录因子表达影响的分析  80-82
  6.Mir-223在PMA诱导K562向巨核系分化中的功能作用  82-84
    6.1 过表达稳定转子pcDNA3.1-pri-mir-223/K562的巨核系分化分析  82-84
讨论  84-97
  1.HSC向粒系分化中的基因表达变化  86-89
  2.ASB-8在粒系分化中的功能  89-94
  3.Mir-223在红系分化中的功能及可能的分子机制  94-97
参考文献  97-105
小结  105-106
文献综述  106-121
攻读博士期间发表和待发表的论文和参加的学术会议  121-122
致谢  122-124

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中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 细胞遗传学
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