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SIVmac239致恒河猴免疫—神经—内分泌缺陷及免疫Ⅰ干预研究

作　者: 潘菊华
导　师: 王阶；卢耀增
学　校: 中国中医科学院
专　业: 中西医结合临床
关键词: 猴免疫缺陷病毒中国恒河猴免疫神经内分泌自身免疫反应益气解毒
分类号: R512.91
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

全球和我国的艾滋病防控形势依然严峻。从机理研究和临床表现显示,艾滋病是一种复杂的、涉及多系统病变的综合征,其免疫-神经-内分泌系统失调的综合发病机制研究越来越受到重视。如何发挥中医药在艾滋病防治中的作用?是目前中医药科研工作者急需解决的重大课题。中医认为,艾滋病具有外感疫毒之邪、多脏腑受损等特点,毒邪是艾滋病的直接致病原因,元气受损、五脏俱虚是艾滋病的主要病机特点,治疗以健脾益气、清热解毒、活血化瘀、益气养阴等方法为主。以益气解毒为治则的经验方免疫Ⅰ治疗艾滋病具有较好的临床疗效。为了进一步研究艾滋病的免疫-神经-内分泌系统的发病机制,并观察免疫Ⅰ的作用,本研究采用中国恒河猴16只,雄性,按体重随机分为正常组(normal, n=4),感染组(n=12)。感染组采用静脉感染SIVmac239建立中国恒河猴艾滋病模型,感染后2周经Taqman探针荧光定量RT-PCR检测血浆SIVRNA确认感染成功。感染后2个月,根据CD3+CD4+绝对计数将感染组随机分为模型组(model, n=6)和治疗组(Immune I, n=6)。治疗组采用灌胃的方法给予免疫Ⅰ,每天1次,每周6天,给药剂量为0.58g/kg,相当于成人常用量的2.9倍。3月为1疗程,共观察2个疗程。安乐死后取材。本研究观察指标包括：(1)一般情况,包括体重、食欲、口腔黏膜、腹泻、咳嗽、舌苔、大便、体温、生化指标等；(2)采用流式细胞仪测定外周血CD3+CD4+、CD3+CD8的绝对计数和CD3+CD4+/CD3+CD8比例；(3)采用流式细胞仪测定外周血CD4+CD25+Foxp3+的比例；(4)采用Taqman探针实时荧光定量RT-PCR法测定血浆中SIV RNA病毒载量；(5)感染前、感染后2个月、治疗1疗程时,无菌手术取腹股沟淋巴结或腋窝淋巴结活检,判断淋巴结的增生、退变、耗竭程度；(6)HE染色观察胸腺、腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏等免疫系统病理变化；Ki-67免疫组化显示淋巴结新生细胞的数量；(7)HE染色观察延脑、桥脑、中脑、大脑、下丘脑、小脑、胸腰神经节等神经系统病理变化,采用分级方法计算病变积分,并计算各神经核神经细胞总数及有核神经细胞数。(8)HE染色观察垂体、肾上腺、睾丸及副睾、甲状腺、松果体等内分泌系统病理变化。研究结果：(1)中国恒河猴感染SIVmac239后,精神变差、体重下降、食欲降低、口腔黏膜溃疡、口腔黏膜微循环变差、腹泻、咳嗽、发热等并发症,该症状与体征与艾滋病的虚损、虚劳、疫毒基本一致。免疫Ⅰ治疗2个疗程后,体重增加,肺部感染、腹泻、发热等并发症发生率下降,口腔黏膜微循环改善。SIVmac239感染后ALB、GGT、CHO、HDL升高,免疫Ⅰ治疗2个疗程能明显降低ALB、GGT,但对CHO、HDL无明显影响。(2)感染SIVmac239后CD3+CD4+T淋巴细胞绝对计数下降,CD3+CD4+/CD3+CD8+逐渐下降,与人感染HIV后的表现基本一致。免疫Ⅰ治疗2个疗程可以明显升高CD3+CD4+T淋巴细胞绝对计数和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值。(3)感染SIVmac239后1-2周,SIV RNA病毒载量达到顶峰(107copies/ml左右),4周后达到较稳定的平台期(104～106copies/ml),与HIV病毒在人体内感染复制的过程较为相似。但免疫Ⅰ治疗2个疗程后SIV RNA病毒载量无明显降低。(4)淋巴结活检显示,感染前,淋巴结呈初始状态,未经受抗原刺激,表现为淋巴滤泡中等大小,生发中心不明显。SIVmac239感染后2月,淋巴滤泡增生,呈轻度退变(±～+),无耗竭。生发中心扩大,明区细胞活跃,髓窦内含淋巴细胞和单核-巨噬细胞。感染后5月,淋巴滤泡增生加重,生发中心可见免疫复合物沉积,引起局部细胞的退变(±～++),血管内皮细胞肿胀,血管增生,淋巴细胞浸润。与模型组相比,治疗组活检淋巴结病变程度相对较轻。(5)试验终末期尸解后淋巴结病理检测发现：正常组轻度退变,2例(±-+),无耗竭。所有感染组恒河猴淋巴结增生(++-+++),3例退变(++-+++),3例耗竭(++～+++)。淋巴结生发中心萎缩甚至消失,副皮质萎缩。微小血管出现淋巴细胞、巨噬细胞浸润,引发局部微循环障碍,致部分或全部淋巴结生发中心萎缩及消失。随着淋巴窦道的运行方向,淋巴组织细胞变性、溶解、消失,出现大量空泡,网状结构溶解消失。与模型组相比,治疗组恒河猴淋巴结增生(++-+++),退变3例,退变程度较模型组减轻(±-+),无耗竭,生发中心明区的免疫复合物沉积较少,未见与淋巴窦道运行相关的淋巴组织细胞变性、溶解、消失。(6)淋巴结Ki-67染色显示SIV感染后10个月时生发中心的新生细胞较少,呈散在分布。免疫Ⅰ治疗后,生发中心集中分布了较丰富的Ki-67阳性细胞,新生细胞较多。(7) SIVmac239感染后,胸腺明显萎缩4例,残余2例。胸腺的皮质和髓质萎缩。哈氏小体停止发育,未角化。脾小体萎缩、退变,髓窦内含较多淋巴细胞和网状细胞。免疫Ⅰ治疗后,能延缓胸腺和脾脏的病变。(8)中国恒河猴感染SIVmac239后,脊髓、延脑、桥脑、中脑、大脑、小脑、神经节各核团出现不同程度的细胞减少、固缩,出现无核细胞,红染加重,细胞质变性,细胞核、核仁、核仁小体消失,部分染色质呈溶解状。神经细胞轴突变短甚至消失。延脑围管浸润、胶质细胞小结、脱髓鞘改变较严重。舌下神经核有核细胞数量明显减少。神经节的病变程度与慢性腹泻的发生呈相关性。慢性腹泻的恒河猴神经节病变较未发生慢性腹泻恒河猴明显减轻。免疫Ⅰ治疗后,对神经系统的多个神经核具有一定程度的保护作用,并能明显提高舌下神经核有核细胞数量,轻度提高迷走神经核和红核的有核神经细胞数量。(9) SIVmac239感染后,垂体、肾上腺、甲状腺、松果体、睾丸及附睾出现了不同程度的病变。垂体嗜酸性细胞减少,炎症细胞浸润。模型组恒河猴大部分肾上腺带状层细胞为蛋白质胞浆,网状层排列不整齐,较多髓质嗜铬细胞排空(4例／6例)。5例模型组恒河猴睾丸生精小管中仅见精原细胞,未见精母细胞和精子,副睾内未见精子,另1例可见少量精子,表现为突出的成精功能障碍。甲状腺腺泡大小不等,胶体着色深浅不一。松果体细胞萎缩,细胞间纤维组织增加,细胞排空明显,分泌功能较差。免疫Ⅰ治疗后,垂体嗜酸性细胞减少的程度较轻,炎症细胞浸润不明显。肾上腺带状层细胞大部分为类固醇胞浆(4例/6例),蛋白质胞浆较少(2例/6例),嗜铬细胞比较饱满；睾丸生精小管中可见精原细胞、精母细胞及少量精子,具有部分成精功能。免疫Ⅰ能明显减轻垂体、肾上腺及睾丸的病变程度。结论及意义：中国恒河猴感染SIVmac239后,表现了与人艾滋病较类似的一般状况。CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值逐渐下降。感染后1-2周,SIV RNA达到顶峰,4周后达到较稳定的平台期。感染后淋巴结的增生逐渐加重,免疫复合物沉积,淋巴滤泡的退变与耗竭,淋巴组织的耗竭与髓窦的分布有关。胸腺皮质、髓质萎缩,哈氏小体停止角化。脾小体变小,髓窦内含淋巴细胞和单核-巨噬细胞。脊髓、延脑、桥脑、中脑、大脑、小脑、神经节各核团出现不同程度的细胞减少、固缩,出现无核细胞,红染加重,细胞质变性,细胞核、核仁、核仁小体消失,染色质呈溶解状。神经细胞轴突变短甚至消失,延脑出现围管浸润、胶质细胞小结、脱髓鞘等严重病变。慢性腹泻与恒河猴神经节病变程度呈正相关。垂体和肾上腺分泌功能下降,睾丸生精小管成精功能障碍,松果体和甲状腺功能轻度减退。猴艾滋病综合表现为免疫-神经-内分泌系统功能缺陷。免疫Ⅰ治疗2个疗程后,能明显改善恒河猴的一般状况,使CD3+CD4+绝对计数、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高。免疫Ⅰ能改善恒河猴淋巴结、胸腺、脾脏病变,使淋巴结新生细胞增多,可能是通过调节SIV引起的自身免疫反应而发挥作用的。对神经系统的多个神经核具有一定的保护作用,并能明显提高舌下神经核有核细胞数量,轻度提高迷走神经核和红核的有核神经细胞数量。对内分泌系统的保护作用主要体现在垂体、肾上腺和睾丸。免疫Ⅰ具有较好的调节猴艾滋病免疫-神经-内分泌系统功能缺陷的作用。本研究从免疫-神经-内分泌多系统缺陷的独特角度探讨恒河猴艾滋病的发病机制,较早提出了SIVmac239感染对恒河猴下丘脑-垂体-肾上腺-性腺轴具有影响,进一步拓展了艾滋病发病机制的内涵,具有较好的理论意义和创新性。另一方面,本研究免疫Ⅰ组方较新颖,对恒河猴艾滋病具有多系统的调节作用,具有较好的临床意义。

全文目录

中文摘要  6-11
Abstract  11-18
主要缩写符号说明  18-20
第1章文献综述  20-38
  综述一艾滋病引起的免疫-神经-内分泌病变  20-29
    参考文献  27-29
  综述二调节性T细胞在HIV研究中的进展  29-38
    参考文献  34-38
第2章实验试剂及仪器  38-42
  1.主要试剂  38-39
  2.缓冲液  39-40
  3.主要仪器设备及其型号  40-41
  4.耗材  41-42
第3章 SIVMAC239所致恒河猴免疫缺陷及免疫Ⅰ保护作用  42-68
  前言  42-44
  材料与方法  44-52
  结果  52-66
  结论  66-68
第4章 SIVMAC239所致恒河猴神经系统损害及免疫Ⅰ保护作用  68-78
  前言  68-69
  材料与方法  69-70
  结果  70-77
  结论  77-78
第5章 SIVMAC239所致恒河猴的内分泌损害及免疫Ⅰ的保护作用  78-88
  前言  78-79
  材料与方法  79-80
  结果  80-86
  结论  86-88
第6章讨论与总结  88-99
  1. 动物模型和病毒株的选择  88-89
  2. 艾滋病是免疫-神经-内分泌失调的综合征  89-92
  3. 艾滋病是自身免疫性疾病  92-93
  4. 艾滋病中药研究现状及免疫Ⅰ的药物作用评价  93-95
  5. 特殊病例的讨论  95-97
  6. 总结及启示  97-99
参考文献  99-104
致谢  104-106
个人简历、博士期间发表论文和研究成果  106-108
中医药科研项目查新报告书  108-116

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